周 園，陳 琦

(渭南市中心醫(yī)院麻醉科，陜西 渭南 714000)

隨著人口老齡化的進展，臨床接受麻醉手術(shù)患者數(shù)量逐年增加，有研究發(fā)現(xiàn)，全身麻醉藥物是患者出現(xiàn)術(shù)后認知功能障礙的因素之一[1]。相關(guān)研究證實嚙齒類動物吸入麻醉藥物后可引起大腦神經(jīng)元凋亡，進而加重其術(shù)后認知功能下降。靜脈麻醉藥物種類較多，臨床上一般復(fù)合使用。丙泊酚是應(yīng)用最為廣泛的全身麻醉藥，有研究認為其對患者認知能力會造成短暫影響[2]。氯胺酮是一種具有鎮(zhèn)痛作用的靜脈麻醉藥，亦有研究表明其可影響患者記憶能力、干擾記憶形成，從而導(dǎo)致認知功能障礙[3]。因此如何為患者提供更安全的麻醉藥物是臨床研究的重點所在。宋程光等[4]指出，半胱氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific protease-3,Caspase-3)基因與細胞凋亡及修復(fù)有關(guān)。故本研究觀察全身麻醉對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦額葉、海馬和杏仁核Caspase-3基因表達的影響，以從基因水平評價麻醉藥物作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選用80只SD大鼠，均為雄性，平均體重(220±20)g，來自北京愛思益普生物科技有限責(zé)任公司。實驗前均進行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)，所有大鼠飼養(yǎng)條件：12/12 h光照(6:00～18:00為光照時間)，溫度在22～25 ℃，濕度在30%～50%，大鼠在飼養(yǎng)時均可自由進食及飲水。試劑：2,6-二異丙基苯酚(生產(chǎn)批號180309)，2-鄰氯苯基-2-甲氨基環(huán)己酮(生產(chǎn)批號180501)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：80只SD大鼠隨機分為四組，每組20只。分別為對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。

1.2.2 全身麻醉：大鼠麻醉前肌注阿托品0.01～0.03 mg/kg，開放靜脈通道后，對照組注射生理鹽水1 ml/kg，不做任何處理。低劑量組、中劑量組、高劑量組分別腹腔注射1.0 mg/kg氯胺酮誘導(dǎo)復(fù)合2 mg/kg丙泊酚、1.5 mg/kg氯胺酮誘導(dǎo)復(fù)合2 mg/kg丙泊酚、2.0 mg/kg氯胺酮誘導(dǎo)復(fù)合2 mg/kg丙泊酚。待大鼠翻正反射消失后，常規(guī)消毒上腹部中線附近，于正中線做一1.5 cm切口，探查腹部15 min后，使用縫線縫合傷口，并使用紅霉素軟膏涂抹，術(shù)中均執(zhí)行無菌操作，保持大鼠呼吸道通暢。麻醉處理后第1天各組分別斷頭取腦10只，分離前額葉皮層、海馬區(qū)、杏仁核，將其放入液氮中，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存。各組其余10只于術(shù)后進行Morris水迷宮測驗。

1.3 觀察指標

1.3.1 Morris水迷宮測試：大鼠麻醉前6 d進行Morris水迷宮[5]定位試驗訓(xùn)練，2次/d，共進行6 d。于大鼠麻醉后第1、2、3天進行測試，大鼠逃避潛伏期：將大鼠面向池壁放入水池中，從其入水至找到隱蔽平臺的時間記為逃避潛伏期，若大鼠找不到隱蔽平臺則引導(dǎo)大鼠至平臺停留數(shù)秒并記潛伏期為60 s，大鼠每天進行4次測試，取當天平均潛伏期為成績。平臺有效期逗留時間為其進行翻轉(zhuǎn)空間探索試驗后到達對側(cè)象限之前的時間。

1.3.2 海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡檢測：采用雙氧水制作大鼠海馬區(qū)組織切片，使用PBS溶液每5 min清洗一次。吸收干凈PBS后，滴加足夠量的TUNEL檢測液，45 ℃避光孵育1 h。PBS溶液清洗后，加入轉(zhuǎn)化劑過氧化物酶37 ℃孵育30 min，PBS清洗后進行DAB染色，蘇木精復(fù)染，脫水封片。顯微鏡(×400)下隨機選擇5個視野觀察凋亡細胞，陽性細胞為染色質(zhì)凝聚或核裂解細胞。

1.3.3 Western blot檢測Caspase-3蛋白濃度：取小鼠海馬組織，研磨打碎后加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上操作提取海馬總蛋白，以測定蛋白濃度。取100 μg海馬總蛋白，使用凝膠電泳成像系統(tǒng)分離蛋白。于5%濃縮膠中濃縮90 min，電壓60 V；12%分離膠中分離150 min，電壓80 V；轉(zhuǎn)膜120 min，電壓120 V。轉(zhuǎn)移后的濾膜使用離子水洗3次，0.5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃過夜。過夜后加入1∶1000稀釋的兔抗人Caspase-3、山羊抗小鼠β-actin一抗，再加入1∶1000稀釋的羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h，洗膜5 min，進行3次，使用電化學(xué)發(fā)光條帶進行顯影，使用Quantity One軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.3.4 Caspase-3基因mRNA水平檢測：使用Trizol法提取細胞DNA，合成cDNA，轉(zhuǎn)入-20 ℃保存；將一個樣本的cDNA稀釋后作為基因定量PCR，擴增條件為95 ℃下變性15 min，94 ℃下變性15 s，72 ℃退火45 s，40個循環(huán)后，于72 ℃下延伸10 min。PCR引物序列見表1。使用1.5%瓊脂凝膠電泳進行分析。

表1 PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮結(jié)果比較 對照組處理后第1、2、3 天逃避潛伏期及平臺有效期逗留時間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；與對照組相比，低劑量組、中劑量組可見麻醉后逃避潛伏期、翻轉(zhuǎn)空間有效逗留區(qū)時間少量增加，但組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，高劑量組明顯增加(均P<0.05)；低劑量組、中劑量組第2、3天逃避潛伏期、翻轉(zhuǎn)空間有效逗留區(qū)時間較術(shù)后第1天縮短(均P>0.05)，高劑量組明顯縮短(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮結(jié)果比較

2.2 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況 對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠神經(jīng)元凋亡率分別為(5.23±0.46)%、(25.35±3.54)%、(27.43±4.14)%、(38.34±4.75)%，組間數(shù)據(jù)相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。高劑量組細胞凋亡率較對照組、低劑量組、中劑量組顯著升高，組間數(shù)據(jù)相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖1。

圖1 TUNEL法檢測各組海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況(×400)(紅綠箭頭為凋亡細胞)

2.3 各組大鼠腦額葉、海馬區(qū)、杏仁核Caspase-3基因表達水平 Western blot結(jié)果顯示，高劑量組Caspase-3蛋白表達量較對照組、低劑量組、中劑量組明顯升高(均P<0.05)。與對照組相比，低劑量組、中劑量組額葉皮層、海馬、杏仁核Caspase-3基因mRNA水平少量增加(均P>0.05);高劑量組Caspase-3基因mRNA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3，圖2、3。

圖2 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

表3 各組大鼠腦額葉、海馬區(qū)、杏仁核Caspase-3基因mRNA水平(Caspase-3/β-actin)

圖3 Western blot檢測各組Caspase-3蛋白表達水平

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，全麻藥物代謝后仍然會對大腦產(chǎn)生功能及形態(tài)上的影響，以及持續(xù)的學(xué)習(xí)能力損害，因此全麻藥物對腦部功能的影響是患者出現(xiàn)術(shù)后認知功能障礙的重要原因之一[6]。腦額葉損傷可降低機體對氣味、行為的敏感性，且孫縵利等[7]認為，阿爾茨海默癥患者前額皮層厚度及神經(jīng)元體積較正常指標更小。海馬區(qū)是與學(xué)習(xí)、行為、記憶相關(guān)的重要腦區(qū)，也是應(yīng)激損傷的靶器官之一。杏仁核是自主神經(jīng)內(nèi)分泌功能的執(zhí)行部位，與記憶恐懼、焦慮有一定關(guān)系。同時，Caspase-3基因是參與細胞凋亡的主要因子。本研究取大鼠細胞腦額葉、海馬區(qū)、杏仁核神經(jīng)細胞Caspase-3基因水平進行觀察，為全身麻醉與術(shù)后不良反應(yīng)提供了新的診療思路。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，丙泊酚等麻醉藥物可增加神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子震蕩，導(dǎo)致軸突生長速度減慢，這可能是因為這類藥物可通過妨礙海馬神經(jīng)元內(nèi)突觸的形成促進神經(jīng)細胞凋亡[8]。尚瑞媛等[9]對大鼠給予氯胺酮進行試驗，結(jié)果顯示目標大鼠出現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡，提示氯胺酮可能會產(chǎn)生一定神經(jīng)毒性，從而改變神經(jīng)系統(tǒng)生理功能。Morris水迷宮可全面、有效反應(yīng)生物的空間認知能力及記憶能力，可廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶、老年癡呆等研究中。本研究對大鼠進行Morris水迷宮試驗，結(jié)果顯示與對照組相比，低劑量組、中劑量組可見麻醉后逃避潛伏期、翻轉(zhuǎn)空間有效逗留區(qū)時間少量增加，高劑量組明顯增加。提示麻醉藥物對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力會產(chǎn)生一定影響。同時，研究結(jié)果顯示，低劑量、中劑量、高劑量組大鼠術(shù)后2 d可恢復(fù)正常，提示合理的麻醉藥物劑量是安全有效的，與喬霖等[10]研究結(jié)果一致。

細胞凋亡是指細胞出現(xiàn)程序性死亡，是指細胞在外界刺激下的生化過程，也是引起機體生長發(fā)育、生理性死亡、病理性死亡的重要機制[11]。且Caspase-3大量激活可導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)酶降解，同時激活核酸內(nèi)切酶，在細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，抑制Caspase-3基因可阻斷神經(jīng)元凋亡，而Caspase-3基因過度表達可促進細胞凋亡[13-14]。黃雄峰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，腦部損傷患者的腦額葉、海馬區(qū)Caspase-3基因表達增加，提示Caspase-3基因是腦組織損傷的原因之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全身麻醉可在一定程度上影響大鼠Caspase-3基因mRNA水平，從而降低大鼠術(shù)后認知能力。且高劑量組Caspase-3蛋白表達量較對照組、低劑量組、中劑量組明顯下降，提示丙泊酚、氯胺酮等全身麻醉藥物可有效激活Caspase-3表達，促進神經(jīng)元凋亡。應(yīng)迪琪等[16]認為，丙泊酚可造成機體海馬區(qū)生成活性氧類物質(zhì)，增加活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而促進神經(jīng)細胞死亡。由此可見，大鼠腦額葉、海馬、杏仁核基因中的Caspase-3基因mRNA水平可促使腦細胞出現(xiàn)凋亡，而高劑量的全身麻醉藥物可促進這一進程，導(dǎo)致腦額葉、海馬、杏仁核中相關(guān)基因表達水平增高，從而實現(xiàn)認知功能下降。本研究結(jié)果得出不同劑量的麻醉藥物對實驗結(jié)果有不同影響，但需要更多實驗來證實。臨床上對全身麻醉后對基因的影響研究還不夠全面，許多研究均使用推理得出結(jié)論，且樣本數(shù)量有限。本研究作為動物實驗，結(jié)果不能完全推廣于人類，但今后的深入研究可為我們進一步明確神經(jīng)細胞凋亡機制，有助于臨床選擇合理麻醉藥物。

綜上所述，高濃度的全身麻醉對腦額葉、海馬、杏仁核Caspase-3基因表達有一定影響，可影響細胞凋亡水平，但影響時間較短，本研究可為今后選擇麻醉藥物劑量、降低相關(guān)不良反應(yīng)做出指導(dǎo)。