岳一鴻, 傅志偉, 陳學(xué)萍, 楊 明, 王寶利, 汪福順

(1.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院, 上海 200444;2.天津大學(xué)表層地球系統(tǒng)科學(xué)研究院, 天津 300072)

烏江(東經(jīng)105°09′ ～109°26′, 北緯25°56′ ～30°01′)位于中國云貴高原東部和四川盆地南緣, 流經(jīng)貴州省北部和重慶市東南部, 在涪陵注入長(zhǎng)江, 是貴州省境內(nèi)最大的河流, 也是長(zhǎng)江上游南岸最大的支流.烏江流域作為我國水能資源的“富礦區(qū)”, 因其徑流量和天然落差都相對(duì)較大, 其梯級(jí)開發(fā)是國家優(yōu)先考慮的流域開發(fā)系統(tǒng)工程之一[1-2].目前, 在烏江流域建成并投入使用的水庫主要有紅楓湖水庫(1960 年)、百花湖水庫(1966 年)、修文水庫(1967 年)、窄巷口水庫(1970 年)、紅巖水庫(1974 年)、烏江渡水庫(1979 年)、東風(fēng)水庫(1994 年)、普定水庫(1994年)、索風(fēng)營(yíng)水庫(2003 年)、引子渡水庫(2003 年)、洪家渡水庫(2003 年)等[3-4].這些梯級(jí)水庫群已成為我國梯級(jí)水庫系統(tǒng)的典型代表.

梯級(jí)水庫在為人類提供大量水電能源的同時(shí), 不可避免地改變了流域原有的生態(tài)環(huán)境.在梯級(jí)開發(fā)形成水庫的過程中, 由于庫區(qū)水位的上升、水流速度的減緩、水體透光性的改變以及自凈能力的減弱、營(yíng)養(yǎng)鹽的積累、水庫的泄洪等因素的改變, 導(dǎo)致水體中原有藻類的種類、數(shù)量和分布發(fā)生顯著性變化[5].浮游藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級(jí)生產(chǎn)者[6], 包括藍(lán)藻、綠藻、硅藻、金藻、甲藻、黃藻、裸藻和隱藻共8 個(gè)門[7].浮游藻類的種類組成、群落結(jié)構(gòu)和豐度變化, 可直接影響水體水質(zhì)、系統(tǒng)內(nèi)能量流、物質(zhì)流和生物資源變動(dòng)[8-10].因而, 浮游藻類的研究對(duì)于水域生態(tài)系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)具有重要的作用, 被認(rèn)為是所屬水域自然環(huán)境及生態(tài)環(huán)境變化的晴雨表.

近年來, 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 憑借著成本低、通量高、流程自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì), 高通量測(cè)序技術(shù)為開展浮游藻類群落結(jié)構(gòu)多樣性研究提供了新的技術(shù)平臺(tái)[11-14].目前, 分子標(biāo)記被用于擴(kuò)增編碼核糖體保守基因的可變區(qū), 進(jìn)而基于高通量測(cè)序技術(shù)的DNA 宏條形碼研究, 使得對(duì)環(huán)境樣品中生物多樣性及復(fù)雜群落結(jié)構(gòu)的評(píng)估成為可能.本研究利用兩對(duì)分子標(biāo)記A23SrV2F/A23SrV2R 和p23SrVF/p23SrVR, 對(duì)烏江流域某水庫不同深度采樣點(diǎn)的水樣擴(kuò)增浮游藻類基因的保守區(qū)段, 利用高通量測(cè)序技術(shù)注釋得到的23 rRNA 基因片段可操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)結(jié)果, 比較所獲得的浮游藻類的覆蓋度來選擇相對(duì)高效的分子標(biāo)記, 為進(jìn)一步開展烏江流域不同梯級(jí)水庫中浮游藻類的種群多樣性研究提供參考和借鑒.

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

采樣時(shí)間是2017 年1 月.首先, 利用分層采水器在烏江流域某水庫水下0, 10 和45 m 深度采集水樣; 然后, 使用直徑47 mm、孔徑0.22 μm 的無菌醋酸纖維濾膜(Whatman, 德國)在砂芯過濾裝置上正壓過濾500 mL 水樣; 最后, 將過濾后的濾膜—20°C 保存, 隨后放置在實(shí)驗(yàn)室—80°C 冰箱凍存.

1.2 DNA 抽提及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增

使用Fast DNA SPIN Kit for Soil 試劑盒(MP, 美國)抽提水樣中的基因組DNA.以基因組DNA 為模板, TransStart Fastpfu DNA Polymerase 為擴(kuò)增酶, 利用PCR 儀(ABI GeneAmp?9700 型)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,對(duì)待測(cè)序區(qū)域進(jìn)行富集,其中A23SrV1F/A23SrV1R(一輪)/A23SrV2F/A23SrV2R(二輪)PCR 反應(yīng)的條件為: 95°C 變性3 min, 95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 45 s, 共30 個(gè)循環(huán); 最后72°C 延伸10 min[15].p23SrVF/p23SrVR PCR 反應(yīng)的條件為: 95°C 變性3 min, 95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 45 s, 共35 個(gè)循環(huán); 最后72°C 延伸10 min[16].表1 為實(shí)驗(yàn)所用的測(cè)序引物.

表1 實(shí)驗(yàn)所用的測(cè)序引物Table 1 Sequencing primers used for test

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物, 并對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化;純化后用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega, 美國)進(jìn)行定量檢測(cè), 并按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求構(gòu)建高通量測(cè)序文庫.使用Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)對(duì)文庫進(jìn)行測(cè)序.

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

在數(shù)據(jù)質(zhì)控處理中, 過濾出尾部質(zhì)量值小于20 的堿基; 根據(jù)雙端(paired-end, PE)讀長(zhǎng)(reads) 之間的重疊(overlap) 關(guān)系, 將成對(duì)reads 拼接成一條序列, 最小overlap 長(zhǎng)度為10 bp, 并篩選掉拼接序列的overlap 區(qū)錯(cuò)配比率大于0.2 的序列; 根據(jù)序列首尾兩端的條形碼(barcode)將嵌合體序列去除, 并調(diào)整序列方向, 然后按照閾(cut off)值將相似性高于97% 的高質(zhì)量序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)的劃分.將所測(cè)得的基因序列通過Blast (http://www.ncbi.nlm.nib.gov/blast/blast.cg) 在Genbank 中進(jìn)行相似序列搜索比對(duì).

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

不同樣品的PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示.可以看出, 所擴(kuò)增的目的片段條帶單一, 片段大小約為410 bp.每個(gè)樣品重復(fù)3 次, 不同樣品的電泳條帶亮度較為一致.

圖1 不同水深樣品中兩對(duì)引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products amplified from the samples at different water depth

2.2 測(cè)序深度與飽和度

對(duì)測(cè)序原始序列剔除原核但保留藍(lán)細(xì)菌門后, 引物A23SrV2F/A23SrV2R 共獲得高質(zhì)量序列99 070 條, 其中深度0 m 樣品的序列數(shù)為35 791 條, 深度10 m 樣品的序列數(shù)為28 881條, 深度45 m 樣品的序列數(shù)為34 398 條.同樣, 引物p23SrVF/p23SrVR 共獲得高質(zhì)量序列103 420 條, 其中深度0 m樣品的序列數(shù)為28 954 條, 深度10 m 樣品的序列數(shù)為32 662 條, 深度45 m 樣品的序列數(shù)為41 804 條.

對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣, 以抽到的序列數(shù)與其代表的OTU 數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線, 結(jié)果如圖2 所示.可以看出, 每個(gè)樣品的稀釋性曲線趨于平坦, 表明測(cè)序量合理, 測(cè)序深度已達(dá)到反應(yīng)樣品中所有OTU 數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn), 測(cè)序結(jié)果在深度2 000 reads 時(shí)能夠真實(shí)反映樣品中藻類的數(shù)量關(guān)系.引物A23SrV2F/A23SrV2R 深度0 m 樣品序列注釋為101 種浮游藻類的OTU,深度10 m 樣品序列注釋為84 種浮游藻類的OTU, 深度45 m 樣品序列注釋為98 種浮游藻類的OTU(見圖2(a)).而引物p23SrVF/p23SrVR 深度0 m樣品序列注釋為172 種浮游藻類的OTU, 深度10 m 樣品序列注釋為140 種浮游藻類的OTU, 深度45 m 樣品序列注釋為236 種浮游藻類的OTU(見圖2(b)).

圖2 不同樣品在97%相似性水平下的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of different samples at the 97% similarity level

2.3 多樣性指數(shù)分析

對(duì)兩對(duì)引物的3 個(gè)采樣點(diǎn)分析選取生態(tài)學(xué)中的評(píng)估指數(shù), 具體如表2 所示.Coverage 是測(cè)序深度指數(shù), 表示各樣品文庫的覆蓋率, 其數(shù)值越高, 則樣本中序列沒有被測(cè)出的概率越低.本次的采樣點(diǎn)Coverage 均在0.999 以上, 說明本次測(cè)序結(jié)果可以代表樣本的真實(shí)情況.在對(duì)3 個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行豐富度分析中, 采用ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù), 二者是估算樣品中浮游藻類豐度的指數(shù), 主要用來估計(jì)群落中含有的OTU 數(shù)目.在A23SrV2F/A23SrV2R 中, 3 個(gè)采樣點(diǎn)的ACE 指數(shù)是86～108, Chao 指數(shù)是85～106, 其中10 m 采樣點(diǎn)種類數(shù)最少, 為85種, 0 m采樣點(diǎn)種類數(shù)最多, 為108 種; 在p23SrVF/p23SrVR 中, 3 個(gè)采樣點(diǎn)的ACE 指數(shù)是153～236, Chao 指數(shù)是157～237, 其中10 m 采樣點(diǎn)種類數(shù)最少, 為153 種, 45 m 采樣點(diǎn)種類數(shù)最多, 為237 種.在對(duì)3 個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行多樣性指數(shù)分析中, 采用Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù), 二者是常用的反映α 多樣性的指數(shù), 用于估算樣品中浮游藻類多樣性的指數(shù), Simpson 指數(shù)值越大, 說明群落多樣性越低; Shannon 值越大, 說明各種個(gè)體分配越均勻, 群落多樣性越高.在A23SrV2F/A23SrV2R 中, 3個(gè)采樣點(diǎn)的Simpson 指數(shù)是0.082～0.111, Shannon 指數(shù)是2.73～2.97, 表明3 個(gè)采樣點(diǎn)樣品間OTUs 數(shù)目的分布差異不大; 在p23SrVF/p23SrVR 中, 3個(gè)采樣點(diǎn)的Simpson 指數(shù)是0.05～0.116, Shannon 指數(shù)是2.82～3.62, 表明3 個(gè)采樣點(diǎn)樣品間OTUs 數(shù)目的分布差異較大.

表2 兩對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物不同采樣點(diǎn)的多樣性指數(shù)比較Table 2 Comparisons of diversity indices in different samples between two pairs of primers

2.4 浮游藻類群落組成分析

對(duì)得到的OTUs 序列進(jìn)行物種注釋, 兩對(duì)引物分別擴(kuò)增的3 個(gè)不同深度采樣點(diǎn)均涵蓋5 門11 屬, 如圖3 所示.在A23SrV2F/A23SrV2R 引物擴(kuò)增的0, 10 和45 m樣品中, 綠藻門(Chlorophyta)占總種類數(shù)的比例分別為22.7%, 25.1%和30.8%, 藍(lán)藻門(Cyanobacteria)占總種類數(shù)的比例分別為17.2%, 42.2%和7.77%, 硅藻門(Bacillariophyta)占總種類數(shù)的比例分別為18.3%, 7.30% 和1.06%, 不等鞭藻門(Heterokonta)占總種類數(shù)的比例分別為1.40%,0.42%和0.81% (見圖3(a)).在p23SrVF/p23SrVR 引物擴(kuò)增的0, 10 和45 m 樣品中, 綠藻門(Chlorophyta)占總種類數(shù)的比例分別為16.7%, 16.6%和36.7%, 藍(lán)藻門(Cyanobacteria)占總種類數(shù)的比例分別為23.1%, 51.7%和3.68%, 硅藻門(Bacillariophyta)占總種類數(shù)的比例分別為15.1%, 6.34% 和1.63%, 不等鞭藻門(Heterokonta)占總種類數(shù)的比例分別為0.95%,0.47% 和2.99% (見圖3(b)).

圖3 各采樣點(diǎn)浮游藻類門類和屬類組成百分比Fig.3 Percentage of different phyla and genera of phytoplankton in different samples identified by two degenerate primes

在高通量測(cè)序結(jié)果中, 兩個(gè)引物在群落組成上存在相同點(diǎn), A23SrV2F/A23SrV2R 和p23SrVF/p23SrVR 引物擴(kuò)增的樣品(見表3)中, 10 m 均以藍(lán)藻為優(yōu)勢(shì)類群, 45 m 均以綠藻門為優(yōu)勢(shì)類群, 而0 m 采樣點(diǎn)主要以綠藻門、藍(lán)藻門和硅藻門為主, 沒有明顯的優(yōu)勢(shì)類群.同時(shí), 兩個(gè)引物在3 個(gè)采樣點(diǎn)占優(yōu)勢(shì)類群的核心OTU 略有不同, A23SrV2F/A23SrV2R引物和p23SrVF/p23SrVR 引物擴(kuò)增(見表4)中, 0 和45 m 的核心OTU 是擬多甲藻屬(Peridiniopsis)(見圖3(c)), 而10 m 的核心OTU 是聚球藻屬(Synechococcus)(見圖3(d)).

表3 各采樣點(diǎn)浮游藻類門類組成百分比Table 3 Percentage of different phyla of phytoplankton in different samples identified by two degenerate primes %

表4 各采樣點(diǎn)浮游藻類屬類組成百分比Table 4 Percentage of different genera of phytoplankton in different samples identified by two degenerate primes %

2.5 樣品OTU 分布Venn 圖分析

為了較為直觀地比較3 個(gè)不同水深采樣點(diǎn)之間OTU 組成的相似程度, 在97% 相似度水平上以O(shè)TU 為單位做成維恩(Venn)圖, 結(jié)果如圖4 所示.在A23SrV2F/A23SrV2R 引物擴(kuò)增的0,10 和45 m 樣品(見圖4(a))中,獨(dú)有的OTU 分別為7,1 和5 個(gè),3 個(gè)采樣點(diǎn)共有的OTU為23 個(gè), 占全部的40.35%; 而在p23SrVF/p23SrVR 引物擴(kuò)增的0, 10 和45 m 樣品中(見圖4(b)), 獨(dú)有的OTU 分別為6, 3 和28 個(gè), 3 個(gè)采樣點(diǎn)共有的OTU 為34 個(gè), 占全部的36.56%.

圖4 各采樣點(diǎn)浮游藻類OTU 分布的Venn 圖Fig.4 Venn diagrams of OUT distribution in different samples identified by two degenerate primes

3 討 論

烏江作為長(zhǎng)江上游南岸最大的支流, 其流域是典型的喀斯特地貌.隨著烏江梯級(jí)水庫的開發(fā)和建立, 烏江流域整個(gè)庫區(qū)的生態(tài)環(huán)境都產(chǎn)生了重大影響.近些年, 國內(nèi)對(duì)烏江梯級(jí)開發(fā)后浮游植物豐度和群落結(jié)構(gòu)的變化都開展了采樣研究.王崇等[17]在2007 年7 月和10 月對(duì)烏江流域的浮游植物種類組成、數(shù)量變化特征及與水環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行調(diào)查, 共鑒定出浮游植物計(jì)7 門75 屬156 種, 包括硅藻門、綠藻門、藍(lán)藻門、裸藻門、甲藻門、隱藻門和金藻門, 其中硅藻門為優(yōu)勢(shì)物種, 占檢出種類的43.6%; 綠藻門和藍(lán)藻門次之, 分別占檢出種類的35.3%和14.1%.任啟飛等[18]在2008 年8 月到2009 年9 月對(duì)紅楓湖水庫浮游植物進(jìn)行14 個(gè)月的定點(diǎn)逐月調(diào)查, 共檢測(cè)到浮游植物72 屬, 分屬8 門, 其中綠藻門為優(yōu)勢(shì)物種, 占總種類的54.2%,藍(lán)藻門和硅藻門分別占總種類數(shù)的19.9% 和15.9%, 同時(shí)也觀察到了金藻門、甲藻門、隱藻門、裸藻門和黃藻門.王叁等[19]于2008 年8 月至2009 年7 月對(duì)百花湖水庫的浮游植物進(jìn)行采樣調(diào)查, 鏡檢結(jié)果共檢測(cè)到浮游植物7 門81 屬, 主要以綠藻門、藍(lán)藻門和硅藻門為主, 分別占41% 、25%和22%.本研究通過高通量測(cè)序技術(shù), 共鑒定出浮游藻類5 門11 屬, 兩對(duì)引物擴(kuò)增的3 個(gè)采樣點(diǎn)(0, 10 和45 m)的浮游植物主要由藍(lán)藻門、綠藻門和硅藻門組成.這與之前對(duì)烏江流域浮游植物的研究結(jié)果相符.兩對(duì)不同引物擴(kuò)增的10 和45 m 樣品中, 優(yōu)勢(shì)群落均為藍(lán)藻和綠藻, 但兩對(duì)引物擴(kuò)增的0 m 樣品中, 綠藻、硅藻和藍(lán)藻三者差別不大.浮游藻類的生長(zhǎng)繁殖與自身的生物特性及CO2、光照、溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽等環(huán)境因子相關(guān), 這可能是引起不同采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)藻類出現(xiàn)差異的原因.

浮游藻類多樣性的研究方法有多種, 在對(duì)烏江流域浮游藻類的群落分布進(jìn)行研究時(shí), 多以傳統(tǒng)鏡檢為主, 即借助顯微鏡觀察藻類細(xì)胞的形態(tài)以確定種類.鏡檢方法工作量大, 主觀性強(qiáng),并對(duì)儀器的分辨率要求很高.武秀國等[20]2013 年4～9 月對(duì)3 種養(yǎng)殖類型池塘的藻類群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鏡檢分析, 共鏡檢出藻類7 門58 種.施擇等[21]于2012 年5 月和12 月對(duì)滇池浮游藻類群落構(gòu)成進(jìn)行了調(diào)查, 共鏡檢出浮游藻類8 門66 屬159 種.本研究中鑒定出的浮游藻類中,不等鞭藻門是烏江流域采樣點(diǎn)從未檢出過的, 表明相對(duì)于傳統(tǒng)鏡檢的方法, 高通量測(cè)序技術(shù)可監(jiān)測(cè)到顯微鏡鏡檢方法檢測(cè)不到的生物物種, 可彌補(bǔ)光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果的不足.

4 結(jié)束語

從20 世紀(jì)80 年代以來, 烏江流域在梯級(jí)水庫蓄水后生態(tài)環(huán)境發(fā)生了改變, 水體自凈能力的降低曾導(dǎo)致水華現(xiàn)象頻發(fā).針對(duì)水體浮游藻類鑒定方法中存在的難題, 本研究利用已報(bào)道的兩對(duì)藻類簡(jiǎn)并引物, 借助高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)3 個(gè)不同水深水層中浮游藻類的多樣性開展研究,為烏江流域不同梯級(jí)水庫中浮游藻類多樣性的研究提供了一種高效的檢測(cè)方法.