岳一鴻, 傅志偉, 陳學(xué)萍, 楊 明, 王寶利, 汪福順
(1.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院, 上海 200444;2.天津大學(xué)表層地球系統(tǒng)科學(xué)研究院, 天津 300072)
烏江(東經(jīng)105°09′ ~109°26′, 北緯25°56′ ~30°01′)位于中國云貴高原東部和四川盆地南緣, 流經(jīng)貴州省北部和重慶市東南部, 在涪陵注入長(zhǎng)江, 是貴州省境內(nèi)最大的河流, 也是長(zhǎng)江上游南岸最大的支流.烏江流域作為我國水能資源的“富礦區(qū)”, 因其徑流量和天然落差都相對(duì)較大, 其梯級(jí)開發(fā)是國家優(yōu)先考慮的流域開發(fā)系統(tǒng)工程之一[1-2].目前, 在烏江流域建成并投入使用的水庫主要有紅楓湖水庫(1960 年)、百花湖水庫(1966 年)、修文水庫(1967 年)、窄巷口水庫(1970 年)、紅巖水庫(1974 年)、烏江渡水庫(1979 年)、東風(fēng)水庫(1994 年)、普定水庫(1994年)、索風(fēng)營(yíng)水庫(2003 年)、引子渡水庫(2003 年)、洪家渡水庫(2003 年)等[3-4].這些梯級(jí)水庫群已成為我國梯級(jí)水庫系統(tǒng)的典型代表.
梯級(jí)水庫在為人類提供大量水電能源的同時(shí), 不可避免地改變了流域原有的生態(tài)環(huán)境.在梯級(jí)開發(fā)形成水庫的過程中, 由于庫區(qū)水位的上升、水流速度的減緩、水體透光性的改變以及自凈能力的減弱、營(yíng)養(yǎng)鹽的積累、水庫的泄洪等因素的改變, 導(dǎo)致水體中原有藻類的種類、數(shù)量和分布發(fā)生顯著性變化[5].浮游藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級(jí)生產(chǎn)者[6], 包括藍(lán)藻、綠藻、硅藻、金藻、甲藻、黃藻、裸藻和隱藻共8 個(gè)門[7].浮游藻類的種類組成、群落結(jié)構(gòu)和豐度變化, 可直接影響水體水質(zhì)、系統(tǒng)內(nèi)能量流、物質(zhì)流和生物資源變動(dòng)[8-10].因而, 浮游藻類的研究對(duì)于水域生態(tài)系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)具有重要的作用, 被認(rèn)為是所屬水域自然環(huán)境及生態(tài)環(huán)境變化的晴雨表.
近年來, 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 憑借著成本低、通量高、流程自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì), 高通量測(cè)序技術(shù)為開展浮游藻類群落結(jié)構(gòu)多樣性研究提供了新的技術(shù)平臺(tái)[11-14].目前, 分子標(biāo)記被用于擴(kuò)增編碼核糖體保守基因的可變區(qū), 進(jìn)而基于高通量測(cè)序技術(shù)的DNA 宏條形碼研究, 使得對(duì)環(huán)境樣品中生物多樣性及復(fù)雜群落結(jié)構(gòu)的評(píng)估成為可能.本研究利用兩對(duì)分子標(biāo)記A23SrV2F/A23SrV2R 和p23SrVF/p23SrVR, 對(duì)烏江流域某水庫不同深度采樣點(diǎn)的水樣擴(kuò)增浮游藻類基因的保守區(qū)段, 利用高通量測(cè)序技術(shù)注釋得到的23 rRNA 基因片段可操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)結(jié)果, 比較所獲得的浮游藻類的覆蓋度來選擇相對(duì)高效的分子標(biāo)記, 為進(jìn)一步開展烏江流域不同梯級(jí)水庫中浮游藻類的種群多樣性研究提供參考和借鑒.
采樣時(shí)間是2017 年1 月.首先, 利用分層采水器在烏江流域某水庫水下0, 10 和45 m 深度采集水樣; 然后, 使用直徑47 mm、孔徑0.22 μm 的無菌醋酸纖維濾膜(Whatman, 德國)在砂芯過濾裝置上正壓過濾500 mL 水樣; 最后, 將過濾后的濾膜—20°C 保存, 隨后放置在實(shí)驗(yàn)室—80°C 冰箱凍存.
使用Fast DNA SPIN Kit for Soil 試劑盒(MP, 美國)抽提水樣中的基因組DNA.以基因組DNA 為模板, TransStart Fastpfu DNA Polymerase 為擴(kuò)增酶, 利用PCR 儀(ABI GeneAmp?9700 型)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,對(duì)待測(cè)序區(qū)域進(jìn)行富集,其中A23SrV1F/A23SrV1R(一輪)/A23SrV2F/A23SrV2R(二輪)PCR 反應(yīng)的條件為: 95°C 變性3 min, 95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 45 s, 共30 個(gè)循環(huán); 最后72°C 延伸10 min[15].p23SrVF/p23SrVR PCR 反應(yīng)的條件為: 95°C 變性3 min, 95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 45 s, 共35 個(gè)循環(huán); 最后72°C 延伸10 min[16].表1 為實(shí)驗(yàn)所用的測(cè)序引物.
表1 實(shí)驗(yàn)所用的測(cè)序引物Table 1 Sequencing primers used for test
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物, 并對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化;純化后用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega, 美國)進(jìn)行定量檢測(cè), 并按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求構(gòu)建高通量測(cè)序文庫.使用Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)對(duì)文庫進(jìn)行測(cè)序.
在數(shù)據(jù)質(zhì)控處理中, 過濾出尾部質(zhì)量值小于20 的堿基; 根據(jù)雙端(paired-end, PE)讀長(zhǎng)(reads) 之間的重疊(overlap) 關(guān)系, 將成對(duì)reads 拼接成一條序列, 最小overlap 長(zhǎng)度為10 bp, 并篩選掉拼接序列的overlap 區(qū)錯(cuò)配比率大于0.2 的序列; 根據(jù)序列首尾兩端的條形碼(barcode)將嵌合體序列去除, 并調(diào)整序列方向, 然后按照閾(cut off)值將相似性高于97% 的高質(zhì)量序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)的劃分.將所測(cè)得的基因序列通過Blast (http://www.ncbi.nlm.nib.gov/blast/blast.cg) 在Genbank 中進(jìn)行相似序列搜索比對(duì).
不同樣品的PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示.可以看出, 所擴(kuò)增的目的片段條帶單一, 片段大小約為410 bp.每個(gè)樣品重復(fù)3 次, 不同樣品的電泳條帶亮度較為一致.
圖1 不同水深樣品中兩對(duì)引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products amplified from the samples at different water depth
對(duì)測(cè)序原始序列剔除原核但保留藍(lán)細(xì)菌門后, 引物A23SrV2F/A23SrV2R 共獲得高質(zhì)量序列99 070 條, 其中深度0 m 樣品的序列數(shù)為35 791 條, 深度10 m 樣品的序列數(shù)為28 881條, 深度45 m 樣品的序列數(shù)為34 398 條.同樣, 引物p23SrVF/p23SrVR 共獲得高質(zhì)量序列103 420 條, 其中深度0 m樣品的序列數(shù)為28 954 條, 深度10 m 樣品的序列數(shù)為32 662 條, 深度45 m 樣品的序列數(shù)為41 804 條.
對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣, 以抽到的序列數(shù)與其代表的OTU 數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線, 結(jié)果如圖2 所示.可以看出, 每個(gè)樣品的稀釋性曲線趨于平坦, 表明測(cè)序量合理, 測(cè)序深度已達(dá)到反應(yīng)樣品中所有OTU 數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn), 測(cè)序結(jié)果在深度2 000 reads 時(shí)能夠真實(shí)反映樣品中藻類的數(shù)量關(guān)系.引物A23SrV2F/A23SrV2R 深度0 m 樣品序列注釋為101 種浮游藻類的OTU,深度10 m 樣品序列注釋為84 種浮游藻類的OTU, 深度45 m 樣品序列注釋為98 種浮游藻類的OTU(見圖2(a)).而引物p23SrVF/p23SrVR 深度0 m樣品序列注釋為172 種浮游藻類的OTU, 深度10 m 樣品序列注釋為140 種浮游藻類的OTU, 深度45 m 樣品序列注釋為236 種浮游藻類的OTU(見圖2(b)).
圖2 不同樣品在97%相似性水平下的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of different samples at the 97% similarity level
對(duì)兩對(duì)引物的3 個(gè)采樣點(diǎn)分析選取生態(tài)學(xué)中的評(píng)估指數(shù), 具體如表2 所示.Coverage 是測(cè)序深度指數(shù), 表示各樣品文庫的覆蓋率, 其數(shù)值越高, 則樣本中序列沒有被測(cè)出的概率越低.本次的采樣點(diǎn)Coverage 均在0.999 以上, 說明本次測(cè)序結(jié)果可以代表樣本的真實(shí)情況.在對(duì)3 個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行豐富度分析中, 采用ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù), 二者是估算樣品中浮游藻類豐度的指數(shù), 主要用來估計(jì)群落中含有的OTU 數(shù)目.在A23SrV2F/A23SrV2R 中, 3 個(gè)采樣點(diǎn)的ACE 指數(shù)是86~108, Chao 指數(shù)是85~106, 其中10 m 采樣點(diǎn)種類數(shù)最少, 為85種, 0 m采樣點(diǎn)種類數(shù)最多, 為108 種; 在p23SrVF/p23SrVR 中, 3 個(gè)采樣點(diǎn)的ACE 指數(shù)是153~236, Chao 指數(shù)是157~237, 其中10 m 采樣點(diǎn)種類數(shù)最少, 為153 種, 45 m 采樣點(diǎn)種類數(shù)最多, 為237 種.在對(duì)3 個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行多樣性指數(shù)分析中, 采用Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù), 二者是常用的反映α 多樣性的指數(shù), 用于估算樣品中浮游藻類多樣性的指數(shù), Simpson 指數(shù)值越大, 說明群落多樣性越低; Shannon 值越大, 說明各種個(gè)體分配越均勻, 群落多樣性越高.在A23SrV2F/A23SrV2R 中, 3個(gè)采樣點(diǎn)的Simpson 指數(shù)是0.082~0.111, Shannon 指數(shù)是2.73~2.97, 表明3 個(gè)采樣點(diǎn)樣品間OTUs 數(shù)目的分布差異不大; 在p23SrVF/p23SrVR 中, 3個(gè)采樣點(diǎn)的Simpson 指數(shù)是0.05~0.116, Shannon 指數(shù)是2.82~3.62, 表明3 個(gè)采樣點(diǎn)樣品間OTUs 數(shù)目的分布差異較大.
表2 兩對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物不同采樣點(diǎn)的多樣性指數(shù)比較Table 2 Comparisons of diversity indices in different samples between two pairs of primers
對(duì)得到的OTUs 序列進(jìn)行物種注釋, 兩對(duì)引物分別擴(kuò)增的3 個(gè)不同深度采樣點(diǎn)均涵蓋5 門11 屬, 如圖3 所示.在A23SrV2F/A23SrV2R 引物擴(kuò)增的0, 10 和45 m樣品中, 綠藻門(Chlorophyta)占總種類數(shù)的比例分別為22.7%, 25.1%和30.8%, 藍(lán)藻門(Cyanobacteria)占總種類數(shù)的比例分別為17.2%, 42.2%和7.77%, 硅藻門(Bacillariophyta)占總種類數(shù)的比例分別為18.3%, 7.30% 和1.06%, 不等鞭藻門(Heterokonta)占總種類數(shù)的比例分別為1.40%,0.42%和0.81% (見圖3(a)).在p23SrVF/p23SrVR 引物擴(kuò)增的0, 10 和45 m 樣品中, 綠藻門(Chlorophyta)占總種類數(shù)的比例分別為16.7%, 16.6%和36.7%, 藍(lán)藻門(Cyanobacteria)占總種類數(shù)的比例分別為23.1%, 51.7%和3.68%, 硅藻門(Bacillariophyta)占總種類數(shù)的比例分別為15.1%, 6.34% 和1.63%, 不等鞭藻門(Heterokonta)占總種類數(shù)的比例分別為0.95%,0.47% 和2.99% (見圖3(b)).
圖3 各采樣點(diǎn)浮游藻類門類和屬類組成百分比Fig.3 Percentage of different phyla and genera of phytoplankton in different samples identified by two degenerate primes
在高通量測(cè)序結(jié)果中, 兩個(gè)引物在群落組成上存在相同點(diǎn), A23SrV2F/A23SrV2R 和p23SrVF/p23SrVR 引物擴(kuò)增的樣品(見表3)中, 10 m 均以藍(lán)藻為優(yōu)勢(shì)類群, 45 m 均以綠藻門為優(yōu)勢(shì)類群, 而0 m 采樣點(diǎn)主要以綠藻門、藍(lán)藻門和硅藻門為主, 沒有明顯的優(yōu)勢(shì)類群.同時(shí), 兩個(gè)引物在3 個(gè)采樣點(diǎn)占優(yōu)勢(shì)類群的核心OTU 略有不同, A23SrV2F/A23SrV2R引物和p23SrVF/p23SrVR 引物擴(kuò)增(見表4)中, 0 和45 m 的核心OTU 是擬多甲藻屬(Peridiniopsis)(見圖3(c)), 而10 m 的核心OTU 是聚球藻屬(Synechococcus)(見圖3(d)).
表3 各采樣點(diǎn)浮游藻類門類組成百分比Table 3 Percentage of different phyla of phytoplankton in different samples identified by two degenerate primes %
表4 各采樣點(diǎn)浮游藻類屬類組成百分比Table 4 Percentage of different genera of phytoplankton in different samples identified by two degenerate primes %
為了較為直觀地比較3 個(gè)不同水深采樣點(diǎn)之間OTU 組成的相似程度, 在97% 相似度水平上以O(shè)TU 為單位做成維恩(Venn)圖, 結(jié)果如圖4 所示.在A23SrV2F/A23SrV2R 引物擴(kuò)增的0,10 和45 m 樣品(見圖4(a))中,獨(dú)有的OTU 分別為7,1 和5 個(gè),3 個(gè)采樣點(diǎn)共有的OTU為23 個(gè), 占全部的40.35%; 而在p23SrVF/p23SrVR 引物擴(kuò)增的0, 10 和45 m 樣品中(見圖4(b)), 獨(dú)有的OTU 分別為6, 3 和28 個(gè), 3 個(gè)采樣點(diǎn)共有的OTU 為34 個(gè), 占全部的36.56%.
圖4 各采樣點(diǎn)浮游藻類OTU 分布的Venn 圖Fig.4 Venn diagrams of OUT distribution in different samples identified by two degenerate primes
烏江作為長(zhǎng)江上游南岸最大的支流, 其流域是典型的喀斯特地貌.隨著烏江梯級(jí)水庫的開發(fā)和建立, 烏江流域整個(gè)庫區(qū)的生態(tài)環(huán)境都產(chǎn)生了重大影響.近些年, 國內(nèi)對(duì)烏江梯級(jí)開發(fā)后浮游植物豐度和群落結(jié)構(gòu)的變化都開展了采樣研究.王崇等[17]在2007 年7 月和10 月對(duì)烏江流域的浮游植物種類組成、數(shù)量變化特征及與水環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行調(diào)查, 共鑒定出浮游植物計(jì)7 門75 屬156 種, 包括硅藻門、綠藻門、藍(lán)藻門、裸藻門、甲藻門、隱藻門和金藻門, 其中硅藻門為優(yōu)勢(shì)物種, 占檢出種類的43.6%; 綠藻門和藍(lán)藻門次之, 分別占檢出種類的35.3%和14.1%.任啟飛等[18]在2008 年8 月到2009 年9 月對(duì)紅楓湖水庫浮游植物進(jìn)行14 個(gè)月的定點(diǎn)逐月調(diào)查, 共檢測(cè)到浮游植物72 屬, 分屬8 門, 其中綠藻門為優(yōu)勢(shì)物種, 占總種類的54.2%,藍(lán)藻門和硅藻門分別占總種類數(shù)的19.9% 和15.9%, 同時(shí)也觀察到了金藻門、甲藻門、隱藻門、裸藻門和黃藻門.王叁等[19]于2008 年8 月至2009 年7 月對(duì)百花湖水庫的浮游植物進(jìn)行采樣調(diào)查, 鏡檢結(jié)果共檢測(cè)到浮游植物7 門81 屬, 主要以綠藻門、藍(lán)藻門和硅藻門為主, 分別占41% 、25%和22%.本研究通過高通量測(cè)序技術(shù), 共鑒定出浮游藻類5 門11 屬, 兩對(duì)引物擴(kuò)增的3 個(gè)采樣點(diǎn)(0, 10 和45 m)的浮游植物主要由藍(lán)藻門、綠藻門和硅藻門組成.這與之前對(duì)烏江流域浮游植物的研究結(jié)果相符.兩對(duì)不同引物擴(kuò)增的10 和45 m 樣品中, 優(yōu)勢(shì)群落均為藍(lán)藻和綠藻, 但兩對(duì)引物擴(kuò)增的0 m 樣品中, 綠藻、硅藻和藍(lán)藻三者差別不大.浮游藻類的生長(zhǎng)繁殖與自身的生物特性及CO2、光照、溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽等環(huán)境因子相關(guān), 這可能是引起不同采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)藻類出現(xiàn)差異的原因.
浮游藻類多樣性的研究方法有多種, 在對(duì)烏江流域浮游藻類的群落分布進(jìn)行研究時(shí), 多以傳統(tǒng)鏡檢為主, 即借助顯微鏡觀察藻類細(xì)胞的形態(tài)以確定種類.鏡檢方法工作量大, 主觀性強(qiáng),并對(duì)儀器的分辨率要求很高.武秀國等[20]2013 年4~9 月對(duì)3 種養(yǎng)殖類型池塘的藻類群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鏡檢分析, 共鏡檢出藻類7 門58 種.施擇等[21]于2012 年5 月和12 月對(duì)滇池浮游藻類群落構(gòu)成進(jìn)行了調(diào)查, 共鏡檢出浮游藻類8 門66 屬159 種.本研究中鑒定出的浮游藻類中,不等鞭藻門是烏江流域采樣點(diǎn)從未檢出過的, 表明相對(duì)于傳統(tǒng)鏡檢的方法, 高通量測(cè)序技術(shù)可監(jiān)測(cè)到顯微鏡鏡檢方法檢測(cè)不到的生物物種, 可彌補(bǔ)光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果的不足.
從20 世紀(jì)80 年代以來, 烏江流域在梯級(jí)水庫蓄水后生態(tài)環(huán)境發(fā)生了改變, 水體自凈能力的降低曾導(dǎo)致水華現(xiàn)象頻發(fā).針對(duì)水體浮游藻類鑒定方法中存在的難題, 本研究利用已報(bào)道的兩對(duì)藻類簡(jiǎn)并引物, 借助高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)3 個(gè)不同水深水層中浮游藻類的多樣性開展研究,為烏江流域不同梯級(jí)水庫中浮游藻類多樣性的研究提供了一種高效的檢測(cè)方法.