陳揚，李朝峰，張雪，趙苑伶，劉妍，劉靜，趙崇軍，林瑞超，馬志強*

（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102；2.中藥品質(zhì)評價北京市重點實驗室，北京 100102）

類風濕性關節(jié)炎是一種常見的自身免疫性疾病，多見四肢關節(jié)滑膜炎，與T 淋巴細胞、Th1 細胞介導的免疫系統(tǒng)功能紊亂密切相關，致殘率較高，急需強效的治療策略［1-3］。傷濕祛痛膏記載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準（中藥成方制劑第8冊）》［4］，由生川烏、生草烏、麻黃、蒼術(shù)、當歸、白芷、干姜、山柰、八角茴香、薄荷腦、冰片、樟腦和水楊酸甲酯等制得，主治風寒濕凝滯筋骨證，常用于治療類風濕性關節(jié)炎［5］，但其成分及作用機制尚不明確。

機體內(nèi)存在自由基的產(chǎn)生與清除，正常情況下處于動態(tài)平衡中。當體內(nèi)自由基過多時，會使機體產(chǎn)生氧化應激反應，導致炎癥反應的產(chǎn)生，因此自由基清除能力是抗炎活性的表征之一［6］。DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）常被用作自由基清除能力評價，其原理是DPPH 從抗氧化劑中吸收一個氫原子，使得其溶液顏色由紫色變?yōu)辄S色，吸光度降低［7］。

白細胞介素-17（IL-17）家族是由IL-17 A～F組成的細胞因子亞群，在急性和慢性炎癥反應中起著至關重要的作用。IL-17 家族通過其相應的受體發(fā)出信號，激活包括NF-κB、MAPKs和C/EBPs在內(nèi)的下游通路，誘導抗菌肽、細胞因子和趨化因子的表達，共同參與機體炎癥及免疫反應進程［8］。

本研究通過超高效液相-線性軌道離子阱-高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對傷濕祛痛膏成分進行了解析，并測定了其氧化自由基清除率來表征其抗炎能力，通過分子對接技術(shù)［9］探究傷濕祛痛膏對經(jīng)典炎癥信號通路IL-17 家族通路靶點的作用效果，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Thermo-LTQ-Orbitrap-XL-HRMSn線性離子阱-串聯(lián)靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，配有：熱噴霧離子源（HESI）、Xcalibur 2.1 化學工作站（美國Thermo Scientific 公司）；Utimate 3000 UHPLC 超高液相色譜系統(tǒng)，含二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD 檢測器（美國Thermo Scientific 公司）；UH5300 型雙光束紫外可見分光光度計（日本株式會社日立制作所）；MS105DU 型萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料及試劑

傷濕祛痛膏浸膏（哈爾濱力強藥業(yè)有限公司）；乙酸（質(zhì)譜級，美國Thermo Scientific 公司）；甲醇（質(zhì)譜級，美國Thermo Scientific 公司）；甲醇（分析純，北京化工廠）；無水乙醇（分析純，北京化工廠）；雙蒸水（香港屈臣氏集團）；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS201012-09）。

1.3 超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：AQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：0.3%乙酸水溶液（A），甲醇溶液（B）；梯度洗脫條件：0～5 min（10%～40%B），5～18 min（40%～60%B），18～30 min（60%～80%B），30～40 min（80%～100%B），40～45 min（100%～100%B）；流速：0.2 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件

HESI 電噴霧離子源，正負離子檢出模式，電離源電壓4 KV，離子源溫度350 ℃，氣化室溫度300 ℃，毛細管電壓25 V，鏡筒透鏡補償電壓110 V，鞘氣和輔助氣為高純氮氣（純度＞99.99%），鞘氣流速40 arb，輔助氣流速20 arb；激活能量單位0.25 q；激活時間30 ms；歸一化碰撞能量35%；傅里葉高分辨掃描范圍m/z 50～1 300 Da，傅里葉變換全掃分辨率為30 000，二級和三級質(zhì)譜選取上一級豐度最高的3 個峰進行碰撞誘導解離碎片掃描。

1.3.3 樣品制備

取一定量的傷濕祛痛膏浸膏用甲醇配制成1 g/mL的母液，超聲30 min，用甲醇稀釋至6.25 mg/mL，12 000 rpm 4 ℃離心15 min，取上清液。

1.4 UV-Vis檢測DPPH自由基清除

1.4.1 DPPH溶液的制備

精密稱取一定量的DPPH，加入一定量的無水乙醇，配制成0.2 mmol/L DPPH母液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.2 供試品溶液的制備

取一定量的傷濕祛痛膏浸膏用90%甲醇水溶液配制成1 g/mL 的母液，超聲30 min，過濾，用90%甲醇水溶液配制成一定濃度的傷濕祛痛膏溶液，取3 mL 傷濕祛痛膏溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，避光反應30 min，待測。

1.4.3 空白組溶液的制備

取3 mL 90%甲醇水溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，避光反應30 min，待測。

1.4.4 對照組溶液的制備

取3 mL 傷濕祛痛膏溶液加入2 mL 90%甲醇水溶液，避光反應30 min，待測。

1.4.5 反應及測定

將避光反應30 min后的供試品、空白組、對照組溶液移取到1 cm 比色皿中，于517 nm 波長下測定，測定3次取平均值。

1.4.6 專屬性考察

取空白組溶液和對照組溶液，在200～900 nm 之間進行全波長掃描，觀察對照組溶液在DPPH 的最大吸收波長處是否有吸收。

1.4.7 線性關系考察

精密移取不同體積的傷濕祛痛膏母液，分別置于25 mL 容量瓶中，加入90%甲醇水溶液至刻度線，定容，配制成不同濃度的傷濕祛痛膏溶液。分別取3 mL不同濃度的傷濕祛痛膏溶液，向內(nèi)加入2 mL 2 mmol/L的DPPH 溶液，避光反應30 min，在517 nm 波長下測定其吸光度均值，計算自由基清除率，線性擬合。

1.5 分子對接

1.5.1 對接分子的準備

使用Chemdraw19 軟件繪制傷濕祛痛膏質(zhì)譜解析成分，能量最小化處理保存成mol2 格式文件，利用SYBYL X2.1.1 軟件進行加氫和加電荷處理，保存成pdb格式。

1.5.2 對接受體的準備

通過KEGG 數(shù)據(jù)庫查詢IL-17 家族通路靶點，在PDB數(shù)據(jù)庫［10］獲得靶點三維結(jié)構(gòu)，利用SYBYL X2.1.1軟件去除水分子及原有配體，加氫、加電荷處理，保存成pdb格式。

1.5.3 柔性分子對接

通過SYBYL X2.1.1 軟件，采用Surflex-Dock 柔性對接算法，選擇“automatic”自動對接方式，每次對接保留Total-score得分前二十的構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 傷濕祛痛膏的化學成分鑒定

采用正負離子模式分別進行掃描，通過和已有文獻報道比對，鑒定出蒼術(shù)（CZ）27 種成分、烏頭（WT）25 種成分、干姜（GJ）20 種成分、白芷（BZ）4 種成分、當歸（DG）4 種成分、八角茴香（BJ）2 種成分、麻黃（MH）2 種成分、山柰（SN）1 種成分，其中多種成分在多味藥中均含有，合計鑒別出85 種成分，主要為生物堿、黃酮、香豆素、二苯基庚烷類化合物，結(jié)果見圖1、表1及表2。

圖1 傷濕祛痛膏總離子流圖

表1 傷濕祛痛膏正離子模式成分定性分析

續(xù)表1

表2 傷濕祛痛膏負離子模式成分定性分析

2.2 UV-Vis檢測DPPH自由基清除

專屬性考察結(jié)果可以看出，傷濕祛痛膏溶液在DPPH 的最大吸收波長處沒有吸收，對測定沒有影響，見圖2。因此，選擇文獻報道［32］的517 nm 作為檢測波長，將待測液與DPPH 溶液避光反應30 min 后測定。以DPPH 自由基清除率Y 為縱坐標，傷濕祛痛膏溶液的濃度X（mg/mL）為橫坐標進行線性回歸，線性考察結(jié)果見表3。傷濕祛痛膏溶液在0.1～0.7 mg/mL 濃度范圍內(nèi)與DPPH 自由基清除率呈良好的線性關系，計算得出DPPH 自由基清除率的半數(shù)抑制濃度IC50值為0.345 7 mg/mL，說明傷濕祛痛膏具有體外清除DPPH自由基的能力，具有一定抗炎活性。

圖2 專屬性考察結(jié)果

表3 線性關系考察結(jié)果

2.3 分子對接

將質(zhì)譜鑒定出的結(jié)構(gòu)明確的62 個成分與IL-17家族通路的55 個靶點，通過SYBYL X 2.1.1 軟件進行分子對接，每次對接顯示得分前二十的對接構(gòu)象，3 410 次對接共產(chǎn)生68 200 個對接構(gòu)象。根據(jù)給出對接打分值Total-score，＞5 分為對接成分與靶點間具有活性，＞7 分為具有很強的活性。使用Origin Lab 將對接結(jié)果繪制成熱圖，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，55 個靶點全部有得分≥5 分的相應對接成分，即傷濕祛痛膏成分對IL-17 家族全部靶點具有對接活性。52 個靶點具有打分值≥7 分的對接成分，占比為94.55%，大部分成分與靶點的對接得分都在7 分以上，并且干姜中的二苯基庚烷類化合物表現(xiàn)出極好的對接活性，與大多數(shù)靶點的得分都在10 分以上。說明傷濕祛痛膏對IL-17 家族炎癥通路的靶點具有良好的對接活性。將對接打分值前十的對接構(gòu)象使用Discovery Studio 2020可視化，結(jié)果見圖4。

圖3 對接結(jié)果Total-score熱圖

圖4 最佳對接構(gòu)象結(jié)果圖

3 討論

DPPH 自由基清除實驗過程中考察了DPPH 的濃度及反應體積，傷濕祛痛膏的濃度、體積及二者的反應時間后，參考文獻確定DPPH 的濃度為2 mmol/mL，反應時間為30 min。

LC-MS 實驗考察了柱溫、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%乙酸水、甲醇-0.3%乙酸水體系，考慮到峰型和分離度，最終選定了30 ℃柱溫、甲醇-0.3%乙酸水為流動相。

類風濕性關節(jié)炎終生患病率高達1%，是最常見的全身性炎癥關節(jié)炎。目前臨床用藥多是甲氨蝶呤聯(lián)合糖皮質(zhì)激素，或者與TNF、B 細胞、T 細胞、白細胞介素的單克隆抗體抑制劑等價格較高的生物制品聯(lián)用［33-35］。傷濕祛痛膏作為治療類風濕性關節(jié)炎等癥的常用藥，具有良好的應用前景。本文通過液質(zhì)聯(lián)用、自由基清除實驗及分子對接方法，闡明了傷濕祛痛膏抗氧化、抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎。

本實驗室前期的網(wǎng)絡藥理學研究表明，傷濕祛痛膏的組成藥味很多，涉及的靶點、通路也較多。本文將關注點放在傷濕祛痛膏成分與經(jīng)典炎癥通路IL-17通路靶點的相互作用。結(jié)果顯示，傷濕祛痛膏的質(zhì)譜鑒定成分對此通路涉及的靶點具有很強的活性。本研究采用的Surflex-Dock 算法是柔性對接方式，研究表明此算法在幾種算法中正確率最高［36-37］。分子對接結(jié)果表明，傷濕祛痛膏可以多靶點起到抗炎作用，且具有良好活性，一定程度上解釋了傷濕祛痛膏治療類風濕性關節(jié)炎等慢性炎癥的科學內(nèi)涵，為傷濕祛痛膏的后續(xù)研究提供一定的參考。