錢舒樂，馮宇，周曼麗，俞赟豐，羅曉欣，張家齊，簡維雄

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）引起的心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）已成為威脅人類健康的首要因素，且日益向年輕化發(fā)展。尋找有效抗AS的策略對于降低CVD 的發(fā)病率和病死率具有重要意義。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心病，coronary atherosclerotic heart disease，CHD）即“胸痹心痛”，其主要病機(jī)為心脈痹阻，病理變化為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，心血瘀阻證（以下簡稱血瘀證）是冠心病最常見的證型之一［1］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為證具有動態(tài)演變的特點(diǎn)，本項(xiàng)目組既往研究證實(shí)，冠心病心血瘀阻證是一個(gè)“血瘀證前期”→“亞血瘀證期”→“心血瘀阻證期”流動的過程［2］。形成初期多為正氣虧虛，心失所養(yǎng)，不榮則病；病情持續(xù)進(jìn)展則痰濁內(nèi)聚，注入血脈，滯塞脈絡(luò)；日久營血瘀滯，痰瘀互結(jié)，沉積血府；最終痹阻心脈，心血瘀阻證形成。

冠心病患者需終身服藥，現(xiàn)階段冠心病的治療仍以西藥為主，但是明顯的副作用是患者良好依從性的一個(gè)考驗(yàn)。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中醫(yī)中藥的治療也逐步進(jìn)入冠心病的防治中，但中藥煎煮方法復(fù)雜、湯劑口感不佳等都是臨床中面臨的問題。中藥材已從過去的中草藥、動物藥和礦物藥等，演變發(fā)展出超微顆粒劑，劑型的變化使中藥兼具療效和便捷成為可能，但是對于不同劑型的藥效眾說紛紜。目前對于顆粒劑膏方的研究有限，為數(shù)不多的研究尚無法排除不同中藥本身所存在的影響因素，故本研究通過觀察不同劑型的中藥膏方對冠心病血瘀證大鼠的作用，利用客觀化的指標(biāo)，評判不同中藥劑型膏方之間的療效，并對其治療機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料

1.1 動物模型

50 只SPF 級雄性SD 健康大鼠［質(zhì)量合格證編號：SYXK（湘）2019-0009］，體質(zhì)量（250±20）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，在人工調(diào)控的環(huán)境中飼養(yǎng)（溫度：22～26 ℃、濕度：50%～70%），自由飲水和飲食，定期更換墊料，消毒籠具。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

甲醇、甲酸、水、乙腈（CNW 公司）；L-2-氯苯丙氨酸（上海恒創(chuàng)生物科技有限公司）；所有化學(xué)藥品和溶劑均為分析純或色譜純。

1.2.2 儀器

全自動樣品快速研磨儀（JXFSTPRP-24/32，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；超聲波清洗機(jī)（SB-5200DT，寧波新芝生物科技有限公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16 MS，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；冷凍濃縮離心干燥器（LNG-T98，太倉市華美生化儀器廠）；高分辨質(zhì)譜儀（QE plus，賽默飛世爾科技公司）；高效液相色譜儀（Dionex U3000 UHPLC，賽默飛世爾科技公司）；色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）（Waters）。

2 方法

2.1 動物造模與分組

2.1.1 造模

按照相關(guān)文獻(xiàn)資料以及本課題組前期研究造模方法［2-6］，分三個(gè)階段復(fù)制冠心病心血瘀阻證大鼠模型。

第一階段：“血瘀證前期”大鼠模型的建立。首先高脂飼養(yǎng)法復(fù)制高脂血癥大鼠模型。飼料配制：3%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%白糖，10%豬油，81.3%基礎(chǔ)飼料。壓制成高脂飼料，進(jìn)行飼喂，第8 天予以維生素D3 溶液灌胃（30 萬IU/kg），第15 天時(shí)再次用維生素D3 溶液灌胃（30 萬IU/kg），第22 天時(shí)繼續(xù)用維生素D3溶液灌胃（20萬IU/kg）。

第二階段：“亞血瘀證期”大鼠模型的建立。將第一階段成模大鼠持續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)至第12周。

第三階段：“心血瘀阻證期”大鼠模型的建立。在第二階段的基礎(chǔ)上，予以皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素（5 mg/kg），連續(xù)1周，記錄注射異丙腎上腺素前后大鼠心電圖，以心電圖J點(diǎn)或ST 段抬高或壓低≥0.1 mV 為成模標(biāo)準(zhǔn)。

大鼠飼養(yǎng)期間，飼料均于每天早上一次性給予，24 h 自由飲水；正常對照組（F）大鼠予以普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠造模全過程以高脂飼料喂養(yǎng)。

2.1.2 分組與給藥

第三階段成模后大鼠（造模期間死亡10 只）采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分4組（每組8只）用于藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)。分別為：蒸餾水干預(yù)的模型對照組（G）、顆粒劑養(yǎng)心通脈膏方干預(yù)的顆粒膏方組（KL）、傳統(tǒng)飲片養(yǎng)心通脈膏方干預(yù)的傳統(tǒng)膏方組（CT）、養(yǎng)心通脈方湯劑組干預(yù)的中藥湯劑組（E），實(shí)驗(yàn)初預(yù)留的大鼠（8 只）作為正常對照組（F）。G 組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，其余組別普通飼料喂養(yǎng)。每日固定時(shí)間灌胃1次，療程21 d。

中藥湯劑組（E）：養(yǎng)心通脈方灌胃（人參、丹參、桂枝、枳實(shí)和澤瀉等）。中藥飲片由廣東一方制藥有限公司提供，每劑中藥分2 次煎煮400 mL 后再濃縮至40 mL。

顆粒膏方組（KL）：顆粒劑養(yǎng)心通脈膏由廣東一方制藥有限公司提供，將膏劑加蒸餾水配制成與湯劑等濃度藥液。

傳統(tǒng)膏方組（CT）：傳統(tǒng)飲片養(yǎng)心通脈膏由廣東一方制藥有限公司提供，將膏劑加蒸餾水配制成與湯劑等濃度藥液。

模型對照組（G）：按等量蒸餾水灌胃。

正常對照組（F）：普通飼料自由飲食，自由飲水。

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動物學(xué)》中灌胃的參考劑量：大鼠灌胃容積為1 mL/100 g，人與大鼠等效劑量換算為人∶大鼠=1∶6.25。中藥則按成人（50 kg）每日每劑服用量400 mL按比例濃縮后灌胃。

2.2 樣本采集與處理

第21天灌胃結(jié)束后，禁食24 h，稱取各組大鼠體質(zhì)量。異氟烷呼吸麻醉大鼠，進(jìn)行心電圖檢測，隨后解剖大鼠取下腹主動脈及左心室心肌于凍存管中，置于-80 ℃冰箱待測。

2.3 檢測條件

本次實(shí)驗(yàn)的分析儀器為Dionex U3000 UHPLC 超高效液相串聯(lián)QE plus 高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。

2.3.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：45 ℃；流動相：A 為水（含0.1%甲酸），B 為乙腈（含0.1%甲酸）；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL。洗脫梯度見表1。

表1 洗脫梯度

2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2.4 生物樣品處理方法

實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：①精確稱取30 mg 組織樣本到1.5 mL EP 管中，加入內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置）20 μL，加入400 μL 甲醇-水（V∶V=4∶1）；②加入2 個(gè)小鋼珠，在-20 ℃冰箱中預(yù)冷2 min 后，放入研磨機(jī)中研磨（60 Hz，2 min）；③冰水浴超聲提取10 min，-20 ℃靜置30 min；④離心10 min（13 000 rpm，4 ℃），取300 μL 上清液裝入LC-MS 進(jìn)樣小瓶中揮干；⑤用200 μL 甲醇-水（V∶V=1∶4）復(fù)溶（渦旋30 s，超聲3 min）；⑥-20 ℃下靜置2 h；⑦離心10 min（13 000 rpm ，4 ℃），用注射器吸取150 μL 的上清液，使用0.22 μm的有機(jī)相針孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移到LC 進(jìn)樣小瓶，-80 ℃下保存，直到進(jìn)行LC-MS分析。⑧質(zhì)控樣本（QC）由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，QC的體積與樣本相同。所有提取試劑使用前均在-20 ℃進(jìn)行預(yù)冷。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)預(yù)處理在進(jìn)行模式識別之前，原始數(shù)據(jù)經(jīng)代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI v2.3 軟件（Nonlinear Dynamics，Newcastle，UK）進(jìn)行基線過濾、峰識別、積分、保留時(shí)間校正、峰對齊和歸一化，其主要參數(shù)：precursor tolerance：5 ppm/10 ppm（自建庫）；product tolerance：10 ppm/20 ppm（自建庫）；product ion threshold∶5%。

對提取到的數(shù)據(jù)，刪除組內(nèi)缺失值均（0值）＞50%的離子峰，并將0 值以最小值的一半替換，并根據(jù)化合物定性結(jié)果打分（Score），對定性得到的化合物進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為36 分（滿分60 分），36 分以下視為定性結(jié)果不準(zhǔn)確并刪除。

多元統(tǒng)計(jì)分析先采用無監(jiān)督的主成分分析（PCA）觀察各樣本之間的總體分布和整個(gè)分析過程的穩(wěn)定性，然后用有監(jiān)督的正交偏最小二乘法分析（OPLSDA）來區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

造模期間，大鼠逐漸出現(xiàn)精神倦怠、反應(yīng)遲鈍等情況，成模的血瘀證大鼠毛色偏黃、枯槁無光澤，精神萎靡，活動減少，呼吸稍快，喜蜷縮成團(tuán)，偶有個(gè)別狂躁，部分大鼠肢端爪甲色紫暗。藥物干預(yù)后，顆粒膏方組、傳統(tǒng)膏方組、中藥湯劑組大鼠精神逐漸好轉(zhuǎn)，活動量增加，反應(yīng)能力及進(jìn)食情況可見恢復(fù)趨勢，組間未見明顯行為差異。正常對照組大鼠始終毛色光澤，反應(yīng)靈敏，活動及飲食均正常。

3.2 心電圖

模型對照組心電圖顯示J點(diǎn)下移約0.1 mV，提示心肌缺血；顆粒膏方組和傳統(tǒng)膏方組心電圖基本成竇性心律，J點(diǎn)無明顯變化，無明顯心肌缺血表現(xiàn)。見圖1。

圖1 各組心電圖

3.3 HE染色

模型對照組的血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)彈性膜崩解斷裂，中膜軟骨化破壞嚴(yán)重，鈣化明顯甚至可見空腔結(jié)構(gòu)，內(nèi)、中、外膜結(jié)構(gòu)不清晰。顆粒膏方組和傳統(tǒng)膏方組的主動脈血管內(nèi)、中、外膜結(jié)構(gòu)基本完整、層次分明，彈性纖維結(jié)構(gòu)清晰。見圖2～圖4。

圖2 模型對照組主動脈HE染色圖（從左至右依次為×40，×100，×200，×400）

圖3 顆粒膏方組主動脈HE染色圖（從左至右依次為×40，×100，×200，×400）

圖4 傳統(tǒng)膏方組主動脈HE染色圖（從左至右依次為×40，×100，×200，×400）

3.4 多元統(tǒng)計(jì)分析

3.4.1 QC樣本質(zhì)控

經(jīng)7-fold crossvalidation（7次循環(huán)交叉驗(yàn)證）得到的PCA 模型圖，QC 樣本等量混合了所有被檢測樣本，圖中QC 樣本緊密聚集，表明此實(shí)驗(yàn)過程中儀器檢測穩(wěn)定性較好，重復(fù)性良好。見圖5。

圖5 所有樣本PCA得分圖

對QC 樣本的代謝物強(qiáng)度做Boxplot，以對其代謝物強(qiáng)度分布進(jìn)行評估，其中Y 坐標(biāo)為質(zhì)譜強(qiáng)度log10 值，QC 樣本的代謝強(qiáng)度集中且穩(wěn)定，表明本次實(shí)驗(yàn)過程質(zhì)譜系統(tǒng)穩(wěn)定性較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。見圖6。

圖6 樣本代謝物強(qiáng)度箱線圖

3.4.2 OPLS-DA分析

正交偏最小二乘方-判別分析（OPLS-DA）是有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法。該方法在PLS-DA 的基礎(chǔ)上進(jìn)行修正，濾除與分類信息無關(guān)的噪音，提高模型的解析能力和有效性，最大化凸顯模型內(nèi)部不同組別之間的差異。在OPLS-DA 得分圖上，有兩種主成分，即預(yù)測主成分和正交主成分。預(yù)測主成分只有一個(gè)而正交主成分可以有多個(gè)。OPLS-DA 將組間差異最大化反映在t1 上，所以從t1 上能直接區(qū)分組間變異，而正交主成分上則反映了組內(nèi)變異。另采用7 次循環(huán)交叉驗(yàn)證（7-fold cross validation）和200 次響應(yīng)排序檢驗(yàn)（response permutation testing，RPT）的方法來考察模型的質(zhì)量，用來衡量模型是否過擬合。

相關(guān)模型參數(shù)為R2X（cum）=0.657，R2Y（cum）=0.998，Q2=-0.307，模型質(zhì)量好。結(jié)果組間區(qū)分明顯，即代謝物存在顯著差異，提示顆粒膏方對模型大鼠有一定治療作用。見圖7。

圖7 顆粒膏方組-模型對照組的OPLS-DA得分圖

相關(guān)模型參數(shù)為R2X（cum）=0.615，R2Y（cum）=0.979，Q2=-0.309，模型質(zhì)量好。結(jié)果組間區(qū)分明顯，即代謝物存在顯著差異，提示傳統(tǒng)膏方對模型大鼠有一定治療作用。見圖8。

圖8 傳統(tǒng)膏方組-模型對照組的OPLS-DA得分圖

相關(guān)模型參數(shù)為R2X（cum）=0.49，R2Y（cum）=0.95，Q2=-0.035，R2Y 和Q2Y 直線的斜率比較接近水平直線，Q2 比較接近于零，因此該模型可能存在過擬合情況。因此雖然圖中顯示存在組間差異，但不排除模型過擬合導(dǎo)致誤差的可能。見圖9和圖10。

圖9 顆粒膏方組－傳統(tǒng)膏方組的OPLS-DA得分圖

圖10 顆粒膏方組－傳統(tǒng)膏方組200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)

相關(guān)模型參數(shù)為R2X（cum）=0.637，R2Y（cum）=0.968，Q2=-0.187，模型質(zhì)量好。結(jié)果組間區(qū)分明顯，即代謝物存在顯著差異，提示中藥湯劑對模型大鼠有治療作用。見圖11。

圖11 中藥湯劑組－模型對照組的OPLS－DA得分圖

3.5 差異代謝物篩選

采用多維分析和單維分析相結(jié)合的辦法，篩選組間差異代謝產(chǎn)物。差異代謝物篩選的標(biāo)準(zhǔn)為：OPLS-DA模型第一主成分的VIP值＞1，T檢驗(yàn)的p-value值＜0.05。經(jīng)篩選后組間差異代謝物數(shù)量見表3。

表3 各比較組差異代謝物數(shù)統(tǒng)計(jì)

3.5.1 組間差異代謝物詳表

組間VIP 值前20 的差異代謝物見表4～表7。其中FC 表示差異倍數(shù)，F(xiàn)C＞1 表示組間比較，差異物上調(diào)，F(xiàn)C＜1則表示下調(diào)。

表4 顆粒膏方組/模型對照組差異代謝物

表5 傳統(tǒng)膏方組/模型對照組差異代謝物

表6 顆粒膏方組/傳統(tǒng)膏方組差異代謝物

表7 中藥湯劑組/模型對照組差異代謝物

3.5.2 火山圖

圖12～圖15中紅色圓點(diǎn)代表在實(shí)驗(yàn)組中顯著上調(diào)的差異代謝產(chǎn)物，藍(lán)色圓點(diǎn)代表顯著下調(diào)的差異代謝產(chǎn)物，灰色點(diǎn)代表不顯著的差異代謝產(chǎn)物。

圖12 顆粒膏方組-模型對照組的火山圖

圖13 傳統(tǒng)膏方組-模型對照組的火山圖

圖14 顆粒膏方組－傳統(tǒng)膏方組火山圖

圖15 中藥湯劑組－模型對照組的火山圖

3.6 代謝通路富集分析

通過對差異代謝物進(jìn)行通路富集分析，有助于理解在差異樣品中代謝途徑變化機(jī)制?；贙EGG 數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析。代謝通路中p-value 為該代謝通路富集的顯著性，選擇顯著性富集pathway 進(jìn)行氣泡圖繪制?？v坐標(biāo)為代謝通路名稱；橫坐標(biāo)為富集因子（Rich factor，Rich factor=顯著差異代謝物個(gè)數(shù)/該pathway 中的總代謝物個(gè)數(shù)），Rich factor 越大，則說明富集程度越大；顏色由綠到紅表示p-value 依次降低；點(diǎn)越大，說明富集到該pathway 上的代謝物數(shù)目越多。

顆粒膏方組與模型對照組差異代謝物進(jìn)行通路富集后，發(fā)現(xiàn)p-value＜0.05 的通路有16 條。分別為蛋白質(zhì)消化吸收（Protein digestion and absorption），壞死性凋 亡（Necroptosis），β-丙氨酸代謝（beta-Alanine metabolism），癌癥的膽堿代謝（Choline metabolism in cancer），戊糖磷酸途徑（pentose-phosphate pathway），血小板活化（Platelet activation），逆行內(nèi)源性大麻素信號（Retrograde endocannabinoid signaling），氨酰tRNA生物合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis），卵巢類固醇生成（Ovarian steroidogenesis），乙醛酸和二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism），味覺傳導(dǎo)（Taste transduction），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（Alanine，aspartate and glutamate metabolism），亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism），不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids），癌癥的中心碳代謝（Central carbon metabolism in cancer）和溶酶體（Lysosome）。見圖16和表8。

圖16 顆粒膏方組－模型對照組氣泡圖

表8 不同比較組之間富集通路統(tǒng)計(jì)列表

顆粒膏方組與模型對照組差異代謝物進(jìn)行通路富集后，發(fā)現(xiàn)p-value＜0.05 的通路有8 條。分別為壞死性凋亡（Necroptosis），卵巢類固醇生成（Ovarian steroidogenesis），不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids），蛋白質(zhì)消化吸收（Protein digestion and absorption），肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)（Regulation of actin cytoskeleton），神經(jīng)活性配體受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction），GnRH 信號通路（GnRH signaling pathway）和利什曼?。↙eishmaniasis）。見圖17和表8。

圖17 傳統(tǒng)膏方組－模型對照組氣泡圖

顆粒膏方組與模型對照組差異代謝物進(jìn)行通路富集后，發(fā)現(xiàn)有且僅有1 條通路，為嘌呤代謝（Purine metabolism）。見圖18和表8。

圖18 顆粒膏方組－傳統(tǒng)膏方組氣泡圖

中藥湯劑組與模型對照組差異代謝物進(jìn)行通路富集后，發(fā)現(xiàn)p-value＜0.05 的通路有14 條。分別為組氨酸代謝（Histidine metabolism），味覺傳導(dǎo)（Taste transduction），ABC transporters，β-丙氨酸代謝（beta-Alanine metabolism），硫代謝（Sulfur metabolism），神經(jīng)活性配體受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction），溶酶體（Lysosome），肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)（Regulation of actin cytoskeleton），F(xiàn)oxO 信號通路（FoxO signaling pathway），氨酰tRNA 生物合成（AminoacyltRNA biosynthesis），甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism），NOD 樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway），尼古丁成癮（Nicotine addiction）和壞死性凋亡（Necroptosis）。見圖19和表8。

圖19 中藥湯劑組－模型對照組氣泡圖

4 討論

秦伯未先生治療胸痹心痛以“扶養(yǎng)心氣、和通血脈”為基本治則［7］，首屆國家級中醫(yī)藥教學(xué)名師袁肇凱教授宗其理念，調(diào)整組方而成的養(yǎng)心通脈方，對CHD心血瘀阻證、高脂血癥、高脂血癥伴胰島素抵抗均具有較好的療效，對于防治冠狀微循環(huán)障礙和微血栓形成，改善心肌供血，緩解心絞痛有確切作用。在機(jī)制學(xué)方面研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)心通脈方具備改善心肌缺血、增加冠狀動脈血流量、促進(jìn)血管再生等心肌修復(fù)功能［8］。本課題組前期開展的臨床研究顯示，養(yǎng)心通脈方對冠心病心絞痛緩解的總有效率為91.7%［9］。王東生等的實(shí)驗(yàn)研究顯示，養(yǎng)心通脈片對動脈粥樣硬化模型大鼠具有顯著降脂作用［10］。

本研究中，根據(jù)心電圖以及主動脈HE 染色結(jié)果可知，養(yǎng)心通脈方顆粒膏方及傳統(tǒng)膏方對冠心病血瘀證模型大鼠均有治療作用，藥物干預(yù)后的大鼠心電圖及主動脈HE 染色切片結(jié)果均有好轉(zhuǎn)趨勢，兩種劑型的膏方均有顯著療效。經(jīng)代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，顆粒膏方組/模型對照組、傳統(tǒng)膏方組/模型對照組、中藥湯劑組/模型對照組組間差異物共同富集的通路是壞死性凋亡（Necroptosis）；顆粒膏方組/模型對照組、傳統(tǒng)膏方組/模型對照組共同富集的代謝通路有蛋白質(zhì)消化吸收（Protein digestion and absorption），卵巢類固醇生成（Ovarian steroidogenesis），不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）；顆粒膏方組/模型對照組、中藥湯劑組/模型對照組共同富集的代謝通路有溶酶體（Lysosome），氨酰tRNA 生物合成（AminoacyltRNA biosynthesis），味覺傳導(dǎo)（Taste transduction）；傳統(tǒng)膏方組/模型對照組、中藥湯劑組/模型對照組共同富集的代謝通路有神經(jīng)活性配體受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction），肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)（Regulation of actin cytoskeleton）。

壞死性凋亡（Necroptosis）結(jié)合了壞死和凋亡的特征，受到一系列特有信號通路的密切調(diào)節(jié)。壞死性凋亡被認(rèn)為是心臟疾病如血管粥樣硬化、缺血再灌注損傷、心肌梗死和心臟重構(gòu)的重要病理、生理學(xué)組成部分［11］。有研究提出，心肌細(xì)胞死亡的調(diào)控形式在心肌梗死再灌注（缺血/再灌注）中起著重要作用［12］。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，顆粒膏方、傳統(tǒng)膏方、中藥湯劑在發(fā)揮對冠心病血瘀證的治療作用中，均涉及了壞死性凋亡這一通路，針對壞死信號通路的干預(yù)可能為心血管疾病的治療提供有益幫助。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)許多中藥復(fù)方或提取物能通過調(diào)控線粒體、死亡受體或ERS凋亡途徑，或調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵因子、通路或靶基因等，發(fā)揮顯著的心肌或血管保護(hù)作用［13］。該通路所含的差異代謝物之一：花生四烯酸，是一種不飽和脂肪酸，也是許多循環(huán)二十烷酸衍生物的生物活性物質(zhì)，如前列腺素E2（PGE2）、前列腺環(huán)素（PGI2）、血栓烷素A2（TXA2）和白細(xì)胞三烯C4（LTC4）的直接前體。這些生物活性物質(zhì)對脂質(zhì)蛋白的代謝、血液流變學(xué)、血管彈性、白細(xì)胞功能和血小板激活等具有重要的調(diào)節(jié)作用，而以上生物環(huán)節(jié)與冠心病血瘀證的形成密切相關(guān)。HUANG 等的研究顯示，發(fā)生AMI 的患者中特定花生四烯酸代謝產(chǎn)物的基線水平明顯高于對照組［14］。魏星的研究亦發(fā)現(xiàn)花生四烯酸是冠心病血瘀證的潛在代謝標(biāo)志物［15］。同時(shí)花生四烯酸還涉及卵巢類固醇生成、不飽和脂肪酸的生物合成兩條通路。KL、CT、E 三組的花生四烯酸水平均高于模型對照組，提示經(jīng)藥物干預(yù)后，花生四烯酸的代謝水平下降，其含量上升并趨向正常組水平，一定程度上可延緩冠心病的進(jìn)展。壞死性凋亡通路所涉及的另一差異代謝物是鞘磷脂，這是動物細(xì)胞膜及其他各種生物膜的主要組成部分。鞘磷脂的代謝產(chǎn)物如神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）、鞘氨醇（sphingosine，Sph）、1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）是具有生物活性的信號分子，可參與細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控，由Cer、Sph和S1P共同構(gòu)成的動態(tài)體系，也被稱作“鞘磷脂變阻器”（Sphingoliiic Rhecostat）［16］。神經(jīng)酰胺作為細(xì)胞第二信使，在心血管系統(tǒng)可以產(chǎn)生多樣的生物學(xué)效應(yīng)：①誘導(dǎo)包括平滑肌及心肌細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞凋亡；②調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的分化和增殖；③調(diào)節(jié)免疫功能和炎癥反應(yīng)；④參與氧化應(yīng)激［17］。研究發(fā)現(xiàn)，鞘磷脂類信號通路參與缺血再灌注損傷［17］，極低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）等致動脈粥樣硬化的脂蛋白都富含鞘磷脂，動脈粥樣硬化病變中鞘磷脂的含量高于正常動脈組織，抑制鞘磷脂的從頭合成可明顯抑制動脈粥樣硬化形成［18］。還有證據(jù)表明，人體血漿鞘磷脂水平是冠狀動脈性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［19-20］，而且可以預(yù)測急性冠狀動脈綜合征患者的預(yù)后［20］。本研究中，KL、CT、E三組的鞘磷脂水平均高于G組，與現(xiàn)有學(xué)說不符合，其深層原因需要進(jìn)一步研究探討。

在其他的代謝通路中，涉及最多的是氨基酸類差異代謝物。鄭景輝等的研究顯示，冠心病血瘀證的代謝通路有氨酰tRNA 生物合成、丙酸代謝等［21］。本次研究發(fā)現(xiàn)了顆粒膏方和中藥湯劑可通過氨酰tRNA 生物合成通路發(fā)揮對冠心病血瘀證的治療作用。該通路涉及的差異代謝物有L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸和L-天冬酰胺。研究表明組氨酸可以作為冠心病血瘀證的潛在生物標(biāo)志物［22-23］，異亮氨酸也是冠心病血瘀證的潛在代謝標(biāo)志物［15］。TAO等通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，冠心病經(jīng)過藥物治療后，其血清的L-賴氨酸含量較治療前發(fā)生顯著變化［24］。還有研究發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈發(fā)生之前會發(fā)生天冬酰胺穩(wěn)態(tài)的改變［25］，對于冠心病有診斷意義。顆粒膏方組、中藥湯劑組較模型對照組L-組氨酸水平顯著下調(diào)，傳統(tǒng)膏方組、中藥湯劑組較模型對照組L-異亮氨酸下調(diào)，顆粒膏方組較模型對照組L-賴氨酸、L-天冬酰胺含量下調(diào)，顆粒膏方組、傳統(tǒng)膏方組較模型對照組丙酸水平顯著下調(diào)，提示養(yǎng)心通脈方可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)氨基酸代謝含量水平而發(fā)揮治療效果。牛磺酸作為游離氨基酸中的一員，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能通過清除自由基，改善冠心病患者血管內(nèi)皮的舒張功能，從而減少心肌受損，在冠心病患者中血液含量明顯低于正常人［26-27］。也有研究發(fā)現(xiàn)高水平的?；撬峥赡軐谛牟』颊呔哂斜Ｗo(hù)作用［28］。中藥湯劑組?；撬岷扛哂谀Ｐ蛯φ战M，表明養(yǎng)心通脈方可以調(diào)節(jié)機(jī)體?；撬岷恳灾委煿谛牟?。目前許多研究表明，冠心病患者存在氨基酸代謝異常，本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)心通脈方治療冠心病血瘀證涉及的差異氨基酸主要有L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-天冬酰胺、牛磺酸。

冠心病血瘀證形成過程還與心肌細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)。乙酰膽堿（Ach）是一種神經(jīng)遞質(zhì)，由膽堿和乙酰輔酶A在膽堿乙酰移位酶（膽堿乙?；福┑拇呋饔孟潞铣?，與三大營養(yǎng)物質(zhì)的氧化供能反應(yīng)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)其涉及了神經(jīng)活性配體受體相互作用、肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、味覺傳導(dǎo)三條通路。引起乙酰膽堿量子性釋放的關(guān)鍵因素是神經(jīng)末梢去極化引起的Ca2+內(nèi)流。當(dāng)神經(jīng)沖動傳至神經(jīng)終板時(shí)，膜電位下降，導(dǎo)致可使Ca2+通過的電壓閘門通道開放，使Ca2+進(jìn)入終板，從而刺激終板分泌乙酰膽堿。傳統(tǒng)膏方組、中藥湯劑組較模型對照組乙酰膽堿含量有下調(diào)趨勢，養(yǎng)心通脈方可能發(fā)揮了類鈣離子拮抗劑的作用，抑制了鈣離子內(nèi)流過程，從而導(dǎo)致Ach含量下調(diào)。在動物細(xì)胞中Ach與受體結(jié)合后，一方面直接影響膜對離子的通透性，另一方面通過各種第二信使影響各種生理過程的進(jìn)行。Ach 可引起許多血管擴(kuò)張，如肺和冠狀血管；但如果血管內(nèi)皮受損，則Ach的上述作用將不復(fù)存在，相反可引起血管收縮。冠心病血瘀證病理狀態(tài)下，其血管內(nèi)皮處于損傷狀態(tài)，此時(shí)Ach的縮血管作用對機(jī)體不利，為提高冠脈血流量引起的Ach水平下降也可能是養(yǎng)心通脈方的作用機(jī)制之一。冠心病血瘀證與肌動蛋白基因及其代謝調(diào)控相關(guān)［29］，這也可能是Ach含量變化的原因之一。檸檬酸是檸檬酸循環(huán)的重要中間代謝物，而檸檬酸循環(huán)又是三大營養(yǎng)素（糖類、脂類、氨基酸）的最終代謝通路，也是三大營養(yǎng)素代謝聯(lián)系的樞紐，更與能量代謝密切相關(guān)。二磷酸腺苷（ADP）為三磷酸腺苷（ATP）水解失去一個(gè)磷酸根，即斷裂一個(gè)高能磷酸鍵，并釋放能量后的產(chǎn)物。ADP也存在于血小板細(xì)胞內(nèi)的高密度顆粒內(nèi)，當(dāng)血小板發(fā)生凝聚反應(yīng)時(shí)被釋放，ADP通過血小板上的ADP受體對血小板的形狀及生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，進(jìn)一步加速血小板的凝聚過程。它是人們發(fā)現(xiàn)最早、也是體內(nèi)最重要的誘導(dǎo)血小板聚集的物質(zhì)，在體外實(shí)驗(yàn)中可觀察到其誘導(dǎo)的兩種血小板聚集類型。顆粒膏方組、中藥湯劑組較模型對照組ADP含量顯著上調(diào)，這可能是養(yǎng)心通脈方發(fā)揮了類ADP 受體拮抗劑的作用，阻止了被釋放的ADP與血小板受體結(jié)合而減弱血小板的凝聚過程，發(fā)揮了“抗血瘀”作用。也可能是冠心病血瘀證本身或者經(jīng)藥物干預(yù)后，ATP與ADP轉(zhuǎn)化的平衡發(fā)生改變所致。也有研究顯示，心肌缺血模型與假手術(shù)組的心肌ADP含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)針刺治療后其心肌ADP含量與心肌缺血模型組亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［30］。因此ADP含量變化的原因及機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

中藥膏方的應(yīng)用歷史悠久，《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載有“馬膏”“豕膏”。豕膏在當(dāng)時(shí)既作外用亦供內(nèi)服，而馬膏僅供外用。至東漢時(shí)期，內(nèi)服膏劑以“煎”的形式出現(xiàn)，如《金匱要略》中記載有“大烏頭煎”［31］，即“大烏頭五枚，水三升，取一升，去渣，納蜜二升，煎令水氣盡，強(qiáng)人服七合，弱人服五合；豬膏發(fā)煎，膏、亂發(fā)，上二味，和膏煎之，發(fā)消藥成，分再服，并從小便出?！逼渲苽浞椒ㄅc現(xiàn)代膏方的制備方法類似。膏方應(yīng)用廣泛，中醫(yī)臨床應(yīng)用涉及內(nèi)、外、婦、兒以及治未病等。范春香等采用加味香砂六君膏方調(diào)治脾胃虛弱型慢性萎縮性胃炎，對52 例患者進(jìn)行服藥后臨床觀察，發(fā)現(xiàn)總有效率達(dá)到88.46%［32］。周韶谷等采用補(bǔ)腎納氣平喘膏方治療兒童支氣管哮喘，將113 例患者隨機(jī)分為治療組（補(bǔ)腎納氣平喘膏方）和對照組（酮替芬），其治療總有效率分別為91.53%和77.78%［33］。代國方等的研究顯示，益氣活血中藥膏方在干預(yù)冠心病冠脈支架植入術(shù)后氣虛血瘀證患者再狹窄有較好作用［34］。膏方具有補(bǔ)虛和治病兩大特點(diǎn)，冠心?。ㄐ乇孕耐矗┲嗅t(yī)病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，其疾病特點(diǎn)決定了患者長期服藥的必要性。膏方服用方便、口感較好、一人一方的優(yōu)點(diǎn)可以極大提高患者的服藥依從性，克服了傳統(tǒng)中藥煎煮繁瑣、入口苦澀等不便，符合現(xiàn)代人群的醫(yī)療需求。本次研究發(fā)現(xiàn)顆粒膏方、傳統(tǒng)膏方及中藥湯劑對冠心病血瘀證均有顯著的治療作用，但是代謝組學(xué)分析的通路顯示各組藥物干預(yù)后的具體代謝情況既有交叉的共性部分，也有各自不同的特異部分。相關(guān)的特異部分可能與膏方制作的配料以及制作工藝有一定關(guān)系，這些變量的影響需要進(jìn)一步研究。

5 小結(jié)

養(yǎng)心通脈方的顆粒膏方、傳統(tǒng)膏方與中藥湯劑均有針對冠心病血瘀證的治療作用，其治療效果無顯著差異，其作用機(jī)制與壞死性凋亡、氨基酸代謝與能量代謝密切相關(guān)，且養(yǎng)心通脈方可能具有類鈣離子拮抗劑、類ADP受體拮抗劑的作用。