尤嘉杰 ，平雙雙 ，劉琪 ，靳翠麗 ，2，周曉見 ，2

（1.揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.揚(yáng)州大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225127）

海水中的人工設(shè)施表面常會發(fā)生大量海洋生物聚集生長的現(xiàn)象，被稱為海洋生物污損（Marine Biofouling）[1]。海洋生物污損給海洋資源開發(fā)帶來嚴(yán)重危害，影響網(wǎng)箱養(yǎng)殖的水體交換和營養(yǎng)競爭，還可能帶來外來生物入侵，危害生態(tài)安全。全球每年由于生物污損造成的各類經(jīng)濟(jì)損失超過200 億美元[2-3]。藤壺 Amphibalanus (Balanus) amphitrite 作為無脊椎污損動物的模式生物，和很多養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)無脊椎動物一樣，幼體階段營浮游生活，成體營底棲生活。藤壺浮游階段包括六個(gè)無節(jié)幼體期和一個(gè)金星幼蟲期，金星幼蟲階段不進(jìn)食，其主要目的是尋找合適的附著點(diǎn)[4]。金星幼蟲有一對觸角，上有嗅覺和觸覺化學(xué)感受器，能感知環(huán)境中合適的誘導(dǎo)附著信號[5]。幼蟲的附著變態(tài)過程需要接受或感知外源信號，然后將外源信號轉(zhuǎn)換成體內(nèi)信號傳遞到特定的部位和組織，并啟動附著、組織凋亡和增生，從而完成變態(tài)過程，最后固著生長在基質(zhì)表面[6]。藤壺分布的群居格局就是通過金星幼蟲期的附著變態(tài)過程實(shí)現(xiàn)的[7]。

藤壺A. amphitrite 產(chǎn)生的糖蛋白復(fù)合物（Settlement Inducing Protein Complex, SIPC）可以高效誘導(dǎo)同物種的幼蟲附著，是指引其群居性的化學(xué)信號物質(zhì)之一。SIPC 是一種糖蛋白，已經(jīng)證明其碳水化合物部分與蛋白質(zhì)部分在誘導(dǎo)金星幼蟲變態(tài)過程中同樣重要。SIPC 亞基中的糖鏈單元對藤壺的幼蟲附著有重要作用[7-8]。另外。海水中物體表面覆蓋著的生物膜由硅藻或細(xì)菌分泌的胞外多聚物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）形成基質(zhì)，其 EPS 也會影響多種底棲無脊椎動物的幼體附著和變態(tài)[9-11]。藤壺觸角上的感受器能夠識別 EPS 中的糖鏈特征[5，10，12]。該文前期工作研究的底棲硅藻Stauroneis sp. 的EPS對藤壺金星幼蟲附著也有良好的誘導(dǎo)作用[13]。所以，糖信號可能是指引藤壺金星幼蟲附著的重要因素。

該文研究4 種單糖以及它們的不同濃度對藤壺金星幼蟲附著的影響，通過分析比較，找出誘導(dǎo)活性最強(qiáng)的單糖種類和濃度，為藤壺幼蟲附著的機(jī)理研究提供基礎(chǔ)試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藤壺幼蟲

藤壺（Amphibalanus amphitrite）成體采自連云港潮間帶（北緯 34°88′，東經(jīng) 119°19′），獲得無節(jié)幼體后，采用Thiyagarajan 等人的方法，在24 ℃下用新鮮人工海水飼養(yǎng)無節(jié)幼體，喂飼纖細(xì)角毛藻（Chaetoceros gracilis），培養(yǎng)5~6 d 后，得金星幼蟲。生物測試之前，金星幼蟲在4 ℃冰箱存放2 d[14]。

1.2 單糖影響金星幼蟲附著的正交試驗(yàn)

4 種單糖 D-甘露糖（Man）、D-葡萄糖（Glc）、D-木糖（Xyl）和L-巖藻糖（Fuc）標(biāo)準(zhǔn)品均購自阿拉丁試劑公司。單糖選擇的依據(jù)有：這些單糖在前期試驗(yàn)中對藤壺金星幼蟲附著表現(xiàn)出較好的誘導(dǎo)活性，是藤壺SIPC 的優(yōu)勢單糖，是藤壺金星幼蟲感受SIPC 的可能識別位點(diǎn)[15]。另外，這些單糖也是該實(shí)驗(yàn)室研究的底棲硅藻Stauroneis sp. EPS 的優(yōu)勢單糖，該硅藻EPS 對藤壺金星幼蟲附著有良好的誘導(dǎo)作用[13]。

根據(jù)前期試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，單糖 Man、Glc、Xyl 的 3 個(gè)濃度分別為 5.00×10-8、1.25×10-8、0.31×10-8mol/L，F(xiàn)uc 的 3 個(gè)濃度分別為 7.60×10-7、1.90×10-7、0.50×10-7mol/L。選擇L9（34）正交表進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)置見表1，共有9 組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)6 次，培養(yǎng)時(shí)間64 h。同時(shí)，另設(shè)置一組對照，對照組不添加單糖。

1.3 藤壺金星幼蟲附著生物測試

24 孔板的每一個(gè)孔中加入1 mL 人工海水（鹽度S=35），再加入20 μL 待測單糖的海水溶液，對照孔僅加20 μL 海水。每個(gè)樣品6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)孔加入金星幼蟲15 個(gè)，24 ℃避光培養(yǎng)。在幼蟲附著培養(yǎng)期間，在 12、20、28 和 64 h 分別記錄每個(gè)孔中死亡、浮游和附著金星幼蟲的數(shù)量，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的附著率[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)6 次，所獲得的數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 22 軟件進(jìn)行分析，繪圖采用Excel 軟件。

分析正交試驗(yàn)組別間的差異，選擇單因素ANOVA 方差分析，利用最小顯著差數(shù)法（LSD 法）進(jìn)行多重比較。進(jìn)行正交試驗(yàn)直觀分析和方差分析，確定4 種單糖的影響力大小及差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，選擇一般線性模型（General Linear Model）/單因變量多因素方差分析（Univariate）/全模型（Full Factorial）分析單糖的主效應(yīng)，確定有顯著性影響的單糖的最適濃度。與對照組進(jìn)行比較，分析藤壺金星幼蟲的附著動力學(xué)，計(jì)算t10、t30、t50和t80（金星幼蟲附著率分別達(dá)到10%、30%、50%和80%時(shí)的附著時(shí)間）[16]，選擇回歸/Probit 計(jì)算 t10、t30、t50和 t80。各分析指標(biāo)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以P=0.050 或0.010 作為標(biāo)準(zhǔn)[17]。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)不同組別的藤壺金星幼蟲附著情況

在不同單糖種類和濃度組合的9 組正交試驗(yàn)處理中，藤壺金星幼蟲都能附著，但在不同的附著時(shí)間點(diǎn)，各組幼蟲附著率有明顯差異（圖1）。

圖1 正交試驗(yàn)不同組別藤壺金星幼蟲附著情況

在附著時(shí)間為12 h 時(shí)，除了第8 和第9 組外，金星幼蟲均有附著，其中第2、3 兩組附著率最高，分別達(dá)到45.5%和40.2%，極顯著高于其他各組（P<0.01）。附著時(shí)間為20 h 時(shí)，附著率最高的仍是第2組，達(dá)到68.9%，其次是第1 和第3 組，分別達(dá)到45.9%和55.5%，極顯著高于其他各組（P<0.01），其它各組藤壺金星幼蟲也均有附著，附著率最低的是第8 組，只有5.8%。在28h 時(shí)，附著率最高的分別是第2、3 組和第1 組，附著率依次達(dá)到72.1%、63.9%和54.8%，極顯著高于其他各組（P<0.01），附著率最低組仍然是第8 組，只有8.1%。在附著時(shí)間為64 h時(shí)，第8 組仍然是附著率最低的，只有42.0%，其次是第4 組，為47.9%，極顯著低于其他各組（P<0.01）。最終，第 1、2、3、6 和第 9 組金星幼蟲附著率均高于70%，最高為第2 組，達(dá)到84.0%。第2 組從12 h 到64 h 的附著時(shí)間內(nèi)，附著率始終保持最高，而第8組則始終處于9 組中附著率最低的狀態(tài)。因此，4 種單糖形成的9 個(gè)組合中，最有利于藤壺金星幼蟲附著的是第 2 組，即 Man（5.00×10-8mol/L）、Glc（1.25×10-8mol/L）、Xyl（1.25×10-8mol/L）和Fuc（1.90×10-7mol/L）的組合誘導(dǎo)金星幼蟲附著的效果最好。

2.2 4 種單糖對藤壺金星幼蟲附著的影響

對正交試驗(yàn)所得到的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，綜合4 個(gè)附著時(shí)間點(diǎn)的效果來看，4 種單糖對藤壺金星幼蟲附著的影響是不同的，影響力由大到小依次為：Man＞Fuc＞Glc＞Xyl。再對正交試驗(yàn)的 4 種單糖進(jìn)行方差分析，以進(jìn)一步確定4 種單糖對藤壺金星幼蟲的影響是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表2。

4 種單糖中，Man 對4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的藤壺幼蟲附著率均有極顯著影響（P<0.01）。Fuc 在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的影響是顯著的，其中在12 h 和20 h 對藤壺幼蟲附著有顯著影響（P<0.05），在64 h 有極顯著影響（P<0.01）。Glc 在2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)對藤壺幼蟲附著的影響是顯著的，在12 h 有顯著性影響（P<0.05），在64 h有極顯著影響（P<0.01）。而Xyl 對4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)藤壺幼蟲附著的影響都不顯著（P>0.05）。因此結(jié)合直觀分析和方差分析的結(jié)果可以得到的結(jié)論是：4 種單糖中Man 對藤壺金星幼蟲附著影響最大且效果是極顯著的，其次影響很大的是Fuc，效果顯著，第三位的單糖是Glc，在一些時(shí)間點(diǎn)顯示出顯著的效果，單糖Xyl 對藤壺金星幼蟲的附著沒有顯著性影響。

表2 4 種單糖對藤壺金星幼蟲附著誘導(dǎo)活性的主效應(yīng)分析（n=6）

附著時(shí)間 變異來源 Man Glc Xyl Fuc 誤差 總數(shù)SS 21 081.6 1 328.0 131.8 2 757.9 16 448.2 41 747.5自由度 2 2 2 2 45 53 20 h MS 10 540.8 664.0 65.9 1 378.9 365.5 F 28.8 1.8 0.2 3.8 P<0.01 >0.05 >0.05 >0.05 28 h SS 19 101.8 1 369.7 901.1 1 749.4 19 225.6 42 347.6自由度 2 2 2 2 45 53 MS 9 550.9 684.9 450.6 874.7 427.2 F 22.4 1.6 1.1 2.0 P<0.01 >0.05 >0.05 >0.05 64 h SS 4 878.3 2 381.8 43.8 3 954.2 8 534.1 19 792.2自由度 2 2 2 2 45 53 MS 2 439.2 1 190.9 21.9 1 977.1 189.6 F 12.9 6.3 0.1 10.4 P<0.01 <0.01 >0.05 <0.01

為了確定正交試驗(yàn)中3 種有顯著性影響的單糖的濃度效應(yīng)，將單糖Man、Fuc 和Glc 按照濃度梯度水平和該水平幼蟲附著率均值作圖[17]。結(jié)果如圖2 所示，當(dāng)Man 單糖濃度從5.00×10-8mol/L降到0.31×10-8mol/L，金星幼蟲附著率持續(xù)下降，呈現(xiàn)出Man 單糖濃度越高，幼蟲附著率越高的規(guī)律，因此Man 誘導(dǎo)金星幼蟲附著活性最強(qiáng)的濃度為 5.00×10-8mol/L（圖 2a）。Fuc 單糖濃度從 7.60×10-7mol/L 降到1.90×10-7mol/L，幼蟲附著率有所上升，再降至0.50×10-7mol/L 時(shí)，附著率則普遍下降，說明Fuc 在1.90×10-7mol/L 濃度時(shí)誘導(dǎo)金星幼蟲附著的活性最強(qiáng)（圖2b）。Glc 濃度從5.00×10-8mol/L 降到1.25×10-8mol/L，幼蟲附著率除了在64 h 時(shí)間點(diǎn)基本持平外，在其他時(shí)間點(diǎn)的幼蟲附著率略有上升，單糖濃度繼續(xù)降低至0.31×10-8mol/L，12 h 幼蟲附著率基本持平，其他時(shí)間點(diǎn)的幼蟲附著率持續(xù)上升，所以對Glc 而言，誘導(dǎo)幼蟲附著活性最強(qiáng)的濃度是0.31×10-8mol/L（圖2c）。因此設(shè)計(jì)誘導(dǎo)藤壺金星幼蟲附著的單糖組合時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮Man，且應(yīng)選取最高濃度，F(xiàn)uc 和Glc分別選取中間濃度和最低濃度，Xyl 的濃度則選取最低濃度即可。

圖2 藤壺金星幼蟲在三種單糖濃度下的附著率

2.3 藤壺金星幼蟲附著的動力學(xué)分析

將添加單糖的9 個(gè)正交試驗(yàn)組和無單糖添加的對照組進(jìn)行比較，分析藤壺金星幼蟲的附著動力學(xué)，計(jì)算各組的 t10、t30、t50和 t80[16]。結(jié)果如表 3 所示，從各附著時(shí)間數(shù)值看，除了第 1、2、3 組外，其余各組的數(shù)值均大于對照組，這意味著達(dá)到相同的幼蟲附著率比對照組需要的附著時(shí)間更長。在第 1、2、3 組中，t10、t30、t50和 t80最小的始終都是第 2組，也就是說第2 組金星幼蟲實(shí)現(xiàn)10%、30%、50%和80%附著率所需要的附著時(shí)間最短，只需3 h就能夠迅速實(shí)現(xiàn)10%的幼蟲附著，而對照組實(shí)現(xiàn)10%附著率需要8.4 h。第2 組快速啟動附著的優(yōu)勢不斷積累，造成t50只需14.5 h，比對照組短9 h，t80保持了用時(shí)短的優(yōu)勢，仍比對照組少5.5 h。因此，添加的單糖組合能加速金星幼蟲附著，使幼蟲附著的時(shí)間進(jìn)程縮短。

表3 藤壺金星幼蟲附著的時(shí)間進(jìn)程特征

3 討論

藤壺?zé)o節(jié)幼體變態(tài)成金星幼蟲后，不再攝食，此時(shí)幼蟲的主要職責(zé)就是尋找到合適的附著地點(diǎn)，成功變態(tài)完成種群的延續(xù)。金星幼蟲尋找附著地點(diǎn)時(shí)，需要化學(xué)信號的指引，這些信號包括SIPC 和環(huán)境中其他的水溶性信號分子。海洋生境中到處存在生物膜，能夠提供誘導(dǎo)藤壺等大型無脊椎污損生物幼蟲附著變態(tài)的信號。生物膜EPS 中的多糖成分，對于大型污損生物幼蟲的附著具有指引或者誘導(dǎo)作用，受到了普遍關(guān)注并不斷得到證實(shí)[9，18-20]。用凝集素LCA 特異性屏蔽SIPC 糖鏈結(jié)構(gòu)中的特定單糖，發(fā)現(xiàn)SIPC 誘導(dǎo)幼蟲附著的活性喪失。凝集素LCA能特異性地和Glc、Man 結(jié)合，所以，糖鏈上的Glc和Man 可能是藤壺幼蟲感受SIPC 附著信號的識別位點(diǎn)[7-8]。而且Man 是SIPC 糖鏈的優(yōu)勢單糖，在糖鏈上形成2~9 單體的聚合單元，另外糖鏈上還含有少量單個(gè)Fuc 和少數(shù)Man 單體形成的低聚單元[15]。因此有理由推測，單糖Man、Glc 和Fuc 可能與金星幼蟲對附著信號的識別有關(guān)。該研究的結(jié)果證實(shí)，單糖 Man、Glc、Xyl 和 Fuc 的組合對藤壺金星幼蟲的附著具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)效果。在這個(gè)組合中，4 種單糖的重要性有所不同。Man 單糖與藤壺金星幼蟲的附著密切相關(guān)，是4 種單糖中誘導(dǎo)附著活性最強(qiáng)的一種。4 種單糖中，只有Xyl 是五碳糖，Man 和Glc 都是六碳糖，比Xyl 具有更多的羥基，與金星幼蟲觸角的極性基團(tuán)結(jié)合更緊密，可能因此導(dǎo)致誘導(dǎo)幼蟲附著的活性更強(qiáng)[19]。Man 具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)金星幼蟲附著的活性，最適濃度為5.00×10-8mol/L；Glc也能誘導(dǎo)幼蟲附著，最適濃度是0.31×10-8mol/L；Fuc 誘導(dǎo)金星幼蟲附著的活性很強(qiáng)，最適濃度是1.90×10-7mol/L，比 Man 和 Glc 的濃度略高；Xyl 在0.31×10-8mol/L 到 5.00×10-8mol/L 濃度之間沒有表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)活性，這說明誘導(dǎo)活性除了和羥基數(shù)量有關(guān)以外，可能還與單糖濃度有關(guān)。大多數(shù)細(xì)胞外信號分子在非常低的濃度下起作用（通常為10-8mol/L），但識別它們的受體親和力不同，可能導(dǎo)致Xyl 需要更高的濃度[5]。因此，單糖的種類和濃度共同決定了金星幼蟲的附著情況。

該研究不僅考察藤壺金星幼蟲最終的附著率，還關(guān)注了幼蟲附著的時(shí)間進(jìn)程，設(shè)置了不同的時(shí)間點(diǎn)觀察幼蟲的附著情況，并分析了藤壺金星幼蟲的附著動力學(xué)，對實(shí)現(xiàn)各附著率所需要的時(shí)間進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加合適濃度的單糖能極大地縮短藤壺金星幼蟲的附著時(shí)間，尤其是在幼蟲附著的早期階段，使幼蟲啟動附著的時(shí)間提前，單糖添加最優(yōu)組達(dá)到10%金星幼蟲附著率的時(shí)間比沒有添加單糖的對照組提前了5.5 h，達(dá)到50%附著率的時(shí)間也縮短了9.0 h。這意味著添加合適種類和濃度的單糖，為金星幼蟲提供了適宜的附著信號，大大減少了幼蟲尋找和探索附著地點(diǎn)的時(shí)間。研究雙殼貝類白櫻蛤Macoma balthica 的面盤幼蟲在硅藻生物膜上的附著試驗(yàn)結(jié)果表明，幼蟲的附著率和穴居率不僅與生物膜中的生物量和EPS 濃度密切相關(guān)，而且流水中的幼蟲附著率明顯低于靜水試驗(yàn)，說明幼蟲快速附著對其成功繁衍的重要性[21]。在藤壺和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)無脊椎動物的實(shí)際生境中，縮短幼蟲的附著進(jìn)程，盡早找到合適的附著地點(diǎn)并啟動附著程序，對于降低幼蟲病死率、提高種群繁衍成功率具有重要意義。