程宵婧，王榮梅，翟畢嬌，公菲菲，侯非凡，王金耀，武 江，邢國(guó)明，亢秀萍，李 森

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西省設(shè)施蔬菜提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西太谷 030801；2.大同黃花產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，山西大同 037004）

萱草屬（Hemerocallis）植物是多年生草本植物，多為二倍體材料[1]，該屬植物遺傳周期長(zhǎng)達(dá)3～4 a，且遺傳背景復(fù)雜，雜合度較高，種間和種內(nèi)生殖隔離嚴(yán)重，創(chuàng)制優(yōu)良種質(zhì)進(jìn)程緩慢，開(kāi)展基因組學(xué)研究較為困難。

利用花藥培養(yǎng)單倍體是一種在遺傳改良、簡(jiǎn)化遺傳背景上具有極大優(yōu)越性的育種方式，是一種可在短暫時(shí)間內(nèi)快速獲得由隱性性狀得到充分體現(xiàn)的雙單倍體，縮短了選育時(shí)間。此外，利用純合體進(jìn)行基因選擇的誤選頻率較低，選擇效果較高[2]。世界上第1 株單倍體植株是曼陀羅花藥培育得到的[3]，而后花藥培養(yǎng)被運(yùn)用到煙草上，并且受到了廣泛的關(guān)注。我國(guó)于1972 年開(kāi)始對(duì)花藥培養(yǎng)進(jìn)行研究，目前已經(jīng)在番石榴、柑橘、小麥等多種植物成功誘導(dǎo)并得到單倍體植株[4-6]，但是萱草屬植物培育單倍體植株未見(jiàn)成功。萱草屬植物花蕾內(nèi)含有6 個(gè)花藥，每個(gè)花藥內(nèi)含有由小孢子發(fā)育而來(lái)的花粉粒。單倍體培養(yǎng)技術(shù)對(duì)于創(chuàng)制具有優(yōu)良性狀的萱草屬植物純合種質(zhì)、加速萱草屬植物育種進(jìn)程具有深遠(yuǎn)研究意義。

開(kāi)展小孢子發(fā)育過(guò)程細(xì)胞學(xué)觀察是明確花藥培養(yǎng)時(shí)期的關(guān)鍵前期基礎(chǔ)，是花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株的關(guān)鍵步驟[7]。植物材料的基因型、培養(yǎng)基蔗糖含量和激素配比是影響花藥培養(yǎng)的重要因素[8]。DIAS[9]對(duì)10 個(gè)青花菜基因型小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，僅7 個(gè)基因型能夠在大量元素較少的培養(yǎng)基中獲得高的胚誘導(dǎo)率。馬菊蘭等[10]對(duì)苜蓿的研究表明，2.0 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L 6-BA 和6%～9%蔗糖可以提高花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率。

本試驗(yàn)對(duì)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)萱草屬植物種質(zhì)資源圃中28 份種質(zhì)材料進(jìn)行小孢子發(fā)育時(shí)期細(xì)胞學(xué)觀察，并對(duì)花蕾大小與小孢子發(fā)育時(shí)期的關(guān)系進(jìn)行分析，對(duì)萱草屬植物花藥離體培養(yǎng)條件進(jìn)行探索，旨在為下一步研究萱草屬植物單倍體育種技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為28 份萱草屬種質(zhì)材料（表1），取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站萱草屬植物種質(zhì)資源圃。

表1 供試材料情況

1.2 花粉小孢子細(xì)胞學(xué)觀察及花蕾長(zhǎng)度測(cè)量

在各萱草屬種質(zhì)材料開(kāi)花前取不同時(shí)期的花蕾，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量花蕾長(zhǎng)度，重復(fù)6 次。將洗凈后的花蕾固定于卡諾氏固定液中，置于4 ℃冰箱中固定12 h 后，采用95%無(wú)水乙醇清洗后置于1 mol/L 鹽酸中60 ℃水浴3 min，再取出花蕾中的花藥使小孢子散出，用卡寶品紅染色后制片，在顯微鏡下觀察不同時(shí)期花藥內(nèi)部小孢子的細(xì)胞形態(tài)特征并拍照。

1.3 花藥預(yù)處理

取28 份萱草屬種質(zhì)處于單核靠邊期的花蕾，置于4 ℃冰箱低溫預(yù)處理24 h 后，流水沖洗5 min放在超凈工作臺(tái)上備用，用75%的酒精處理30 s，滅菌雙蒸水清洗1～2 次，用0.1%升汞處理6 min，滅菌雙蒸水清洗2～3 次，將花蕾解離，取出花藥備用。

1.4 花藥離體培養(yǎng)基因型、蔗糖濃度和激素濃度比例的篩選

以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加4 mg/L 維生素B1促進(jìn)愈傷組織的生成，花藥離體培養(yǎng)的基因型篩選采用培養(yǎng)基Y1、Y2，蔗糖濃度篩選采用培養(yǎng)基T1～T3，激素濃度篩選采用培養(yǎng)基H1～H28，各培養(yǎng)基配方如表2 所示。每個(gè)處理30 瓶，每瓶接種6 個(gè)花藥，重復(fù)3 次。培養(yǎng)室溫度（25±2）℃、遮光布遮蓋進(jìn)行暗培養(yǎng)。每天記錄不同處理花藥離體培養(yǎng)效果，45 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel 2019 和SAS 9.2 分別進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。

表2 培養(yǎng)基配方

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)觀察

對(duì)28 份萱草屬植物連續(xù)動(dòng)態(tài)的花藥小孢子發(fā)育時(shí)期進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，獲得萱草屬植物小孢子各發(fā)育時(shí)期的特征，如圖1 所示。通過(guò)觀察可將小孢子發(fā)育過(guò)程分為6 個(gè)時(shí)期，即小孢子母細(xì)胞時(shí)期、減數(shù)分裂期、單核前期、單核靠邊期、二核三核期、成熟花粉粒時(shí)期。單核靠邊期時(shí)細(xì)胞體積增大達(dá)到正常大小，細(xì)胞核變小，液泡將細(xì)胞核擠向細(xì)胞壁較厚的一側(cè)。

2.2 28份萱草屬植物花蕾長(zhǎng)度與小孢子發(fā)育時(shí)期的關(guān)系分析

表3 萱草屬植物小孢子各發(fā)育時(shí)期花蕾長(zhǎng)度比較 mm

續(xù)表3

不同萱草屬植物小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)應(yīng)花蕾長(zhǎng)度不同。由表3 可知，各萱草屬植物隨著小孢子發(fā)育成熟，花蕾長(zhǎng)度也隨之增加。小孢子母細(xì)胞時(shí)期、減數(shù)分裂期、單核前期、單核靠邊期、二核三核期、成熟花粉粒時(shí)期的花蕾長(zhǎng)度分別為1.87～3.50、3.28～5.66、4.38～7.16、5.82～8.74、6.73～11.52、7.77～12.56 mm。

2.3 萱草屬植物花藥離體培養(yǎng)條件分析

2.3.1 基因型對(duì)萱草屬植物花藥離體培養(yǎng)效果的影響

由表4 可知，在28 個(gè)萱草屬種質(zhì)資源中，僅4 個(gè)基因型誘導(dǎo)出愈傷組織。H0003 在Y1 培養(yǎng)基中可以誘導(dǎo)出綠色致密愈傷組織，愈傷率最高，可達(dá)90%，在Y2 培養(yǎng)基中未誘導(dǎo)出愈傷組織；H0006、H0021均能產(chǎn)生愈傷組織，但顏色稍有差異；H0095 誘導(dǎo)愈傷效果較差，產(chǎn)生黃白色愈傷組織，后期褐化。

2.3.2 蔗糖濃度對(duì)萱草屬植物花藥離體培養(yǎng)效果的影響 由表5 可知，在蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L 時(shí)，H0006 和H0095 均在花藥膨大后發(fā)生褐化。隨著蔗糖質(zhì)量濃度升高，花藥培養(yǎng)效果顯著改善，且H0006 愈傷率始終高于H0095。

2.3.3 激素配比對(duì)萱草屬植物花藥離體培養(yǎng)效果的影響 28 份萱草屬植物在H1～H10 培養(yǎng)基培養(yǎng)效果較好，在其余培養(yǎng)基培養(yǎng)最終導(dǎo)致花藥褐化失活。由表6 可知，與H1（0 mg/L 2，4-D＋0 mg/L KT）培養(yǎng)基相比，添加不同濃度的2，4-D、KT 的培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷組織質(zhì)量存在差異，H0003 于H3 培養(yǎng)基中培養(yǎng)效果較好，產(chǎn)生綠色致密愈傷組織，適于分化培養(yǎng)。H0006 于H3 和H7培養(yǎng)基中培養(yǎng)效果較佳，愈傷率可達(dá)90%。

表4 基因型對(duì)萱草屬植物花藥離體培養(yǎng)效果的影響

表5 蔗糖濃度對(duì)萱草屬植物花藥離體培養(yǎng)的影響

表6 激素濃度配比對(duì)花藥離體培養(yǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

植物雄核的離體培養(yǎng)主要包括小孢子培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)，少數(shù)植物可以通過(guò)離體花蕾培養(yǎng)獲得單倍體[8]。雄核發(fā)育的多樣性一般與小孢子發(fā)育時(shí)期、基因型和培養(yǎng)條件等因素有關(guān)[8]。小孢子發(fā)育時(shí)期是影響花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，植物花粉小孢子發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，可分為6 個(gè)時(shí)期：小孢子母細(xì)胞時(shí)期、減數(shù)分裂期、單核前期、單核靠邊期、二核三核期以及成熟花粉粒時(shí)期?；ㄋ幵诓煌l(fā)育階段誘導(dǎo)愈傷組織的能力明顯不同。成熟花藥不能誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體，通常處于單核前期，單核靠邊期的花藥誘導(dǎo)效果最好[11]。本研究中使用了單核靠邊期的花藥進(jìn)行組織培養(yǎng)，這與丹參[12]、番茄[13]進(jìn)行花藥培養(yǎng)所選外植體時(shí)期一致。

基因型在植物花藥離體培養(yǎng)過(guò)程中影響效果顯著。甘泉等[14]通過(guò)對(duì)16 個(gè)不同基因型的粳稻進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)，結(jié)果表明，不同基因型粳稻的愈傷誘導(dǎo)能力不同且分化效果差異顯著。本試驗(yàn)中28 種不同基因型材料花藥離體培養(yǎng)效果差異顯著，僅4 個(gè)基因型能誘導(dǎo)出愈傷組織，在相同培養(yǎng)條件下H0003 生長(zhǎng)狀態(tài)最好，H0006、H0021 次之，H0095 培育效果較差，這與前人研究結(jié)果一致。

在植物花藥離體培養(yǎng)中，培養(yǎng)條件對(duì)花藥培養(yǎng)效果也具有一定影響。不同蔗糖濃度條件下，離體雄核誘導(dǎo)發(fā)育效果不同。李冰冰[15]在培養(yǎng)基中添加20 g/L 蔗糖培養(yǎng)韭菜花藥，成功誘導(dǎo)出組培苗。在本試驗(yàn)中，H0006 的花藥接種于含有30 g/L 蔗糖的培養(yǎng)基中外植體先膨大后逐漸褐化，生長(zhǎng)狀況差，隨著蔗糖濃度的升高，褐化現(xiàn)象減弱，愈傷組織顏色由黃綠色到綠色，花藥培養(yǎng)效果顯著提高；H0095在90 g/L 蔗糖的培養(yǎng)基中才能誘導(dǎo)出黃綠色愈傷組織，在蔗糖濃度低的情況下，花藥均褐化，說(shuō)明H0095 適合在蔗糖濃度高的培養(yǎng)基中產(chǎn)生愈傷。

2，4-D、BA、KT、ZT 等激素對(duì)花藥離體培養(yǎng)效果影響顯著。甜菊花藥在1.5 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA 的培養(yǎng)基中極易誘導(dǎo)愈傷；草莓花藥在1.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L 2，4-D 的培養(yǎng)基上最易誘導(dǎo)且促進(jìn)花藥愈傷組織形成；仙客來(lái)花藥在0.1 mg/L NAA＋1.0 mg/L 6-BA 的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷[16-18]。在本試驗(yàn)中，設(shè)置2，4-D 和KT、6-BA 的不同濃度梯度組合，2，4-D 和KT 較適合于萱草屬植物花藥離體培養(yǎng)，不同基因型材料之間培養(yǎng)效果差異顯著。

本試驗(yàn)對(duì)萱草屬植物花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)研究獲得了階段性研究成果，為選擇小孢子的適宜選材時(shí)期和最佳培養(yǎng)基提供了直接證據(jù)，為小孢子培養(yǎng)單倍體植株奠定了前期基礎(chǔ)。