崔秀婷，劉 俊，耿雅萍，田欣涓，劉亞令

（1.山西農業(yè)大學生命科學學院，山西太谷 030801；2.中國藥科大學藥學院，江蘇南京 211198）

甘草屬（Glycyrrhiza Linn.），屬于豆科蝶形花亞科，為多年生草本或半灌木，世界范圍內約有20 種，大部分分布在歐亞大陸，且集中分布在亞洲中部。其中，我國有8 種，主要分布于黃河流域以北的省區(qū)，在云南西北部發(fā)現了個別種[1]。藥材甘草為豆科植物烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）或脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Batalin）的甘草根及根莖[2]。藥用甘草中含有多種活性成分，具有抗氧化、抗炎、調節(jié)免疫力、抗?jié)?、解毒、抗肝纖維化等藥理作用，可與多種中藥配伍，藥效平緩，多起調和藥性的作用。目前，已從中分離出300 余種黃酮類成分，20 余種三萜皂苷類成分及多糖成分[3]，楊瑞等[4]對市售藥用甘草成分的含量測定表明，不同基原甘草的藥效有明顯不同，在臨床應用中應區(qū)別對待。但在實際市場上，由于中藥材甘草根部形態(tài)十分相似，采用傳統方法對中藥形狀、顏色、氣味等進行鑒定，存在著較大的主觀性和經驗性[5]，不能達到較好的鑒定效果。要準確鑒別藥用甘草品種，需要從多個方面進行，比較繁瑣復雜[6]。因此，探尋一種準確、有效、快速的鑒定方法十分必要。

DNA 條形碼（DNA barcoding）由加拿大分類學家HEBERT 等提出[7]，是利用基因組中一段標準短序列來進行物種鑒定，具有準確快速、重復性和穩(wěn)定性高的優(yōu)點，是近年來基于分子標記技術發(fā)展起來的一種物種鑒定新技術。DNA 條形碼技術與傳統鑒定方法相比，是基于物種基因型的差異鑒定，且僅需少量組織材料即可實現物種鑒定，是傳統鑒定方法的有效補充[5]。眾多研究者對適合作為植物的DNA barcoding 進行了積極的探索，對ITS2、matK、psbKpsbI、rbcL、rpoB、rpoC1、psbA-trnH、rps4、trnL-trnF 和atpF-atpH 等條形碼進行了研究[8]。其中，rbcL＋matK在生命條形碼國際聯盟植物工作組的建議下被作為核心條形碼，隨后生命條形碼聯盟植物工作組在第三屆國際DNA 條形碼會議上建議將葉綠體psbA-trnH 片段和核基因片段ITS 作為補充條形碼[9]。

隨著DNA 分子條形碼的發(fā)展，ITS、ITS2、psbAtrnH、matK 與rbcL 等相繼對甘草屬植物嘗試鑒別，得出利用ITS2 序列和psbA-trnH 序列2 種DNA條形碼鑒定甘草屬植物效果最好[10-11]。陳士林等[12]建議選用ITS2 和psbA-trnH 序列為植物類藥材的核心條形碼，同時建立了中藥材DNA 條形碼鑒定體系，其良好的鑒定能力也已得到眾多研究者的認可[13-16]。由于目前對甘草屬雜交區(qū)親本和雜交類群形態(tài)分化沒有明確的分類依據和認識，在實際應用時易把雜交種當成親本種，造成藥用甘草資源應用和研究的混亂，種源不清，質量無保障等問題[17]。

本試驗以ITS2 為主，psbA-trnH 為輔對同域分布的藥用甘草物種從分子水平上進行種類鑒別，旨在為藥用甘草新品種選育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗收集了烏拉爾甘草（ura-N）、脹果甘草（inf-A）、光果甘草（gla-A）、脹果光果雜種甘草（G-A）4 類甘草種共20 個樣本硅膠干燥葉片，其中，烏拉爾甘草樣本5 個，采集于新疆尼勒古縣；脹果甘草、光果甘草以及脹果光果雜種甘草樣本分別5 個，采集于新疆阿拉爾。4 類甘草種樣本的形態(tài)略有不同，烏拉爾甘草復葉長1.50～4.10 cm，葉緣稍皺或平坦，小葉數2～8 片；脹果甘草復葉長1.50～4.10 cm，葉緣皺，小葉數3～7 片；光果甘草復葉長4.25～12.40 cm，葉緣平滑，小葉數9～15 片；脹果光果雜種甘草復葉長5.50～12.00 cm，葉緣微皺，小葉數5～11 片。

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA 提取 本試驗采用改良的CTAB 法[18]提取樣本DNA。取0.020 0 g 干燥葉樣在液氮中研磨成粉末，將其置于1.5 mL 離心管中，加入預熱至65 ℃的CTAB 提取緩沖液1 mL、β－巰基乙醇1 μL，混勻，放入65 ℃水浴鍋中水浴1 h，期間需上下顛倒3～4 次。水浴后冷卻至室溫，10 000 r/min 離心7 min，取上清液并加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，顛倒數次，12 000 r/min離心5 min；再次取上清液加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提，顛倒數次，12 000 r/min 離心10 min；取上清液加入2.5 倍體積無水乙醇，倒置數次，置-20 ℃冷凍30 min，8 000 r/min 離心5 min，挑出的絮狀沉淀，用70%的酒精清洗2 次，室溫晾干至無酒精味。用50 μL 的TE 溶解，即為DNA 模板。

1.2.2 PCR 擴增及測序 根據《中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導原則》[12]進行ITS2 序列和psbA-trnH序列的擴增。PCR 反應體系和擴增程序[19]如表1 所示。取5 μL 的PCR 擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，恒壓100 V，30 min 左右，用紫外凝膠成像儀觀察并切割目標條帶進行測序（由上海生工生物工程股份有限公司完成）。

1.3 數據分析

測序后的序列經CExpress 軟件序列拼接、校對，導入到DNAMAN 軟件中獲取多序列比對圖；在MEGA 7.0 軟件上進行全局比對，比對后的序列統計GC 含量，同時采用Kimura 2-parameter（K2P）計算遺傳距離，并基于鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發(fā)育樹，NJ 樹各分支的置信度用boot-strap text 作1 000 次可信度分析。

表1 PCR 反應體系和擴增程序

2 結果與分析

2.1 PCR 擴增產物檢測

通過CTAB 法對所有藥用甘草樣本進行DNA提取，利用超微量核算蛋白測定儀對樣本DNA 質量進行檢測，得各樣本DNA 的A260/A280值范圍為1.64～2.05，符合DNA 純度質量標準，可用于后續(xù)試驗。利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR 擴增產物檢測，結果顯示，ITS2 序列擴增產物條帶范圍在400～500 bp（圖1），psbA-trnH 序列擴增產物條帶約500 bp（圖2），目標片段均與預期相符。

2.2 ITS2 及psbA-trnH 序列變異分析

利用軟件MEGA 7.0 對ITS2 及psbA-trnH 序列進行堿基信息統計，結果顯示，ITS2 序列保守位點有217個，變異位點為6 個，變異率為2.69%，簡約信息位點有3 個；psbA-trnH 序列保守位點有216 個，變異位點184 個，變異率為43.60%，簡約信息位點有59 個。

利用DNAMAN 對ITS2 和psbA-trnH 進行多序列比對，結果如圖3 所示，4 類甘草屬植物在ITS2序列16～18 bp 位點處，烏拉爾甘草樣本多為TGC（除烏拉爾甘草3 號堿基變?yōu)镃AC 外），脹果甘草、光果甘草及脹果光果雜種甘草在此處均為CAA；在30、89、102 bp 處脹果甘草9 號與其他脹果甘草樣本相比均存在變異，分別為C-A、C-T、A-T；psbAtrnH 序列中，4 類甘草屬植物變異位點較多（圖4），在245～249、303～305 bp 均存在堿基缺失（圓圈），只有光果gla-A3 為CGTAC、TAC，在228～232 bp 位點處其他序列多為ATCAG，gla-A3 為TAATC（方框），在348～351 bp 處其余光果樣本多為AAGT，而gla-A3 為ACAG（方框）；在脹果甘草和雜交種中，inf-A9 和G-A14 存在多個位點變異（短橫線）。此外，在330 bp 位點處烏拉爾甘草和光果甘草堿基多為G，脹果甘草與脹果光果雜種甘草為A。

2.3 基于ITS2 及psbA-trnH 序列種內種間遺傳距離分析

表2 甘草屬各種間、種內遺傳距離

由表2 可知，ITS2 序列中，烏拉爾甘草與光果、脹果、脹果光果雜種甘草的種間遺傳距離分別是0.014 5、0.011 8、0.011 8，均大于種內遺傳距離和其他種間遺傳距離；脹果甘草與光果甘草、脹果光果雜種甘草的種間遺傳距離均為0.002 7，顯著小于種內遺傳距離。psbA-trnH 序列中，脹果光果雜種甘草雜種與烏拉爾甘草、光果、脹果的種間遺傳距離分別為0.110 1、0.111 0、0.110 8，且均小于種內遺傳距離；脹果與烏拉爾甘草、光果的種間遺傳距離為0.077 5、0.078 5，且均小于種內遺傳距離。可能與inf-A9 和G-A14 的變異位點較多有關。

2.4 ITS2 及psbA-trnH 序列系統發(fā)育樹分析

利用MEGA 7.0 軟件對樣本的ITS2 序列構建系統發(fā)育樹，結果如圖5 所示，系統發(fā)育樹基本分為兩大支，其中，烏拉爾甘草單獨聚為一支；脹果甘草，光果甘草，光果脹果雜種甘草聚為另一支，說明ITS2 可將烏拉爾甘草與脹果甘草、光果甘草、光果脹果雜種甘草區(qū)分開來。

利用MEGA 7.0 軟件對樣本的psbA-trnH 序列構建系統發(fā)育樹如6 所示，NJ 樹基本分為2 個大支，其中，光果脹果雜種甘草與脹果甘草聚為一支；烏拉爾甘草與光果甘草聚為另一支。表明光果脹果雜種甘草的遺傳背景偏向于脹果甘草，烏拉爾甘草與光果甘草的親緣關系較近。

2.5 ITS2 及psbA-trnH 序列的GC 含量分析

通過MEGA 7.0 軟件對藥用甘草ITS2 和psbA-trnH 序列的GC 含量進行分析，結果如表3 所示，ITS2 序列長度均為223 bp，烏拉爾甘草的GC平均含量為53.36%，與光果甘草、脹果甘草及光果脹果雜種甘草的GC 含量差異分別為0.45、0.45、0.63 百分點。psbA-trnH 序列長度在384～407 bp，脹果光果雜種甘草與脹果甘草之間的GC 含量差異最大，為3.70 百分點，與烏拉爾甘草之間的GC含量差異次之，為3.61 百分點，與光果甘草之間差異為2.91 百分點。

表3 ITS2 和psbA-trnH 序列的GC 含量分析

3 結論與討論

利用條形碼序列ITS2 和psbA-trnH 進行物種鑒定是現代藥用植物鑒定中的常用手段，袁俊杰等[20]利用種間K2P 距離和系統進化樹對10 種蒼耳屬雜草的鑒定表明，ITS 和psbA-trnH 序列是鑒別蒼耳屬雜草較理想的條形碼。趙海等[21]以psbA-trnH為主、ITS2 為輔，對黔太子參2 個人工選育品種黔太子參1 號和太子參豐抗1 號進行了明確鑒定。本試驗利用ITS2 和psbA-trnH 序列對烏拉爾甘草、脹果甘草、光果甘草和脹果光果雜種甘草進行序列比對和系統發(fā)育樹構建，在ITS2 序列16～18 bp 位點處烏拉爾甘草堿基為TGC，脹果甘草、光果甘草、脹果光果雜種甘草均為CAA，可將烏拉爾甘草與其他3 類甘草屬植物區(qū)分開，這與郝杰等[10]基于ITS2序列的藥用甘草親緣關系鑒定研究的結果一致；psbA-trnH 在330 bp 處烏拉爾甘草和光果甘草堿基為G，脹果甘草與脹果光果雜種甘草在此位點處為A，可將脹果甘草與光果甘草分開，這與楊瑞等[4]利用ITS 和psbA-trnH 變異位點對不同基原甘草的分子鑒定及市售甘草藥材的質量評價所得的結果相似。ITS2 序列16～18 bp 和psbA-trnH 序列330 bp 位點可以作為3 類已知甘草屬物種的鑒別位點。而脹果甘草與脹果光果雜種甘草親緣關系較近，需要補充其他序列進一步分析鑒定。

有研究發(fā)現，物種間的GC 含量差異可反映其親緣關系的遠近，蔡秀珍[22]利用ITS 序列中外類群海芋與內類群芋屬植物的GC 含量相差不到1%，得出海芋屬和芋屬是2 個親緣關系較近的類群。王丹等[23]通過ITS 序列中綠藻門植物TLD2A1 同其小球藻屬的物種比對發(fā)現，二者之間GC 含量差異不足1.4%，得出二者親緣關系較近。本試驗通過對烏拉爾甘草、脹果甘草、光果甘草及脹果光果雜種甘草ITS2 序列的GC 含量差異分析可知，烏拉爾甘草與其余材料的GC 含量差異最大，與遺傳距離和系統發(fā)育樹結果保持一致。但是psbA-trnH 序列的GC 含量差異分析顯示，脹果甘草與光果甘草GC含量差異為0.79 百分點，說明二者之間親緣關系較近，這可能與同域分布、自然居群中存在種間雜交基因滲透有關[24]。在psbA-trnH 序列中，光果脹果雜種甘草與光果甘草和脹果甘草之間的GC 含量差異分別為2.91、3.70 百分點，說明光果脹果雜種甘草與光果甘草的親緣關系較近，而系統發(fā)育樹中可見光果脹果雜種甘草與脹果甘草聚為一大支。出現此差異可能因為一是psbA-trnH 序列較其他葉綠體序列變異率較高，植物分化時葉綠體基因組中G、C 位點相對于A、T 位點更容易發(fā)生突變[25]；二是各物種分化后顯著的生活環(huán)境差異影響（A＋T）/（G＋C）的值[26]；三是psbA-trnH 序列為葉綠體基因，遵循細胞質遺傳，在世代雜交過程偏離孟德爾分離[27]，導致ITS2 和psbA-trnH 序列GC 含量分析結果出現差異。因此，序列的GC 含量與藥用甘草的親緣關系是否存在必然聯系還有待進一步研究。

本試驗利用ITS2 和psbA-trnH 對20 個藥用甘草樣本進行分子鑒定，通過分析各序列的堿基信息、變異位點、系統發(fā)育樹及GC 含量，得出ITS2 序列長223 bp，可從中區(qū)分烏拉爾甘草；psbA-trnH 序列長度為384～407 bp，可進一步將光果甘草區(qū)分。表明以ITS2 序列為主、psbA-trnH 序列為輔的鑒定體系具有良好的鑒定能力，但此鑒定體系無法將脹果甘草與光果脹果雜種甘草區(qū)分開，更精準的鑒定仍需進一步試驗研究。本試驗研究結果結合傳統形態(tài)學鑒定將為藥用甘草的種類鑒定提供雙重保障。