吳柳燕，付莉，付品，朱佳敏，趙玉雪，楊霞

（貴州省核桃研究所，貴州貴陽 550002）

我國核桃栽培面積居世界首位，核桃青皮含有生物堿、鞣質(zhì)、多酚類、黃酮類、單寧類、香豆素、萜類、甾類和有機酸物質(zhì)等多種有機化合物，因此具有一定的植物源農(nóng)藥活性。堆置在野外的核桃青皮經(jīng)雨水漫泡后，浸出液流入江、河、湖泊中，河水變黑，魚、蝦全被毒死，對水體造成嚴重污染；而且核桃青皮中的纖維木質(zhì)素含量高，堿性較強，在自然界中降解速度慢，不易腐爛，堆置在田間則導致莊稼（甚至雜草）難以生長。研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮質(zhì)地松軟，有機質(zhì)含量高，干青皮含纖維素約17%，木質(zhì)素約43%，還含有較高的K、Ca以及Fe、Mn、Zn、Mg、Cu等微量元素。

梁林波等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在核桃青皮堆肥過程中加入微生物發(fā)酵菌劑能使堆肥溫度升高，大大縮短堆肥時間，加快核桃青皮的堆肥腐熟。鑒于此，筆者研究微生物發(fā)酵劑對核桃青皮的發(fā)酵效果，以期挑選出對核桃青皮降解效果最好的微生物發(fā)酵劑，不僅能有效緩解核桃青皮還田帶來的環(huán)境污染，還能為核桃青皮制成生物有機肥奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

①微生物發(fā)酵劑：鄭州啟富農(nóng)業(yè)科技有限公司；②有機物料發(fā)酵劑：君德生物科技有限公司；③沃寶：河南沃寶生物科技有限公司；④青皮腐解物：撥開堆積的青皮腐解物，5點法取內(nèi)部樣品，置于無菌袋中，4℃保存?zhèn)溆?；⑤森林土壤：除? cm表層土壤，取5～10 cm土壤樣品，置于無菌袋中，去掉草根、石子后過1 mm篩，4℃保存?zhèn)溆茫虎轈K：對照不加任何發(fā)酵劑。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1濾紙條崩解培養(yǎng)基。(NH4)2SO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、酵母粉0.1 g、濾紙條1 cm×6 cm 3條/瓶，pH 7.0，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.2.2核桃青皮降解率測定培養(yǎng)基。干燥的青皮粉末5 g、（NH4）2SO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.02 g，5 mmol/L pH=7的磷酸緩沖液15 mL，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.3 濾紙條崩解試驗

稱取0.5 g不同的發(fā)酵樣品，加入50 mL濾紙條崩解培養(yǎng)基中，50℃靜止培養(yǎng)，記錄pH變化情況。濾紙剛分解斷裂時，轉接于同樣新鮮培養(yǎng)液中，如此分別轉接數(shù)代后，記錄崩解情況。

1.4 纖維素酶活性測定

分別取各發(fā)酵劑培養(yǎng)7 d的濾紙條（濾紙是聚合度中等的纖維素材料[2]，其活力代表了總纖維素酶活力）培養(yǎng)基上清液1 mL，按照以下步驟進行纖維素酶活性測定。

1.4.1標準曲線繪制。無水葡萄糖80℃烘至恒重，制成1 mg/mL標準液，取6支試管分別加入標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，補加蒸餾水至2 mL，加入DNS試劑1.5 mL，沸水浴5 min，冷卻后定容至25 mL，分光光度計540 nm下測OD值。

1.4.2粗酶液制備。配制復篩培養(yǎng)基每瓶45 mL，接入5 mL種子懸液，置于28℃搖床中培養(yǎng)，3、7、11 d分別取1.5 mL于離心管中，10 000 r/min離心10 min得粗酶液。

1.4.3酶活性測定。取1 mL培養(yǎng)基上清液，10 000 r/min離心10 min得粗酶液。加入1 mL質(zhì)量分數(shù)1%CMC-Na溶液，在45℃下恒溫水解20 min，加入1.5 mL DNS顯色，沸水浴5 min，冷卻后定容至25 mL，分光光度計540 nm下測OD值（m1）。另外做對照，取上清1 mL，加入1 mL蒸餾水，在45℃下恒溫水解20 min，加入1.5 mL DNS顯色，沸水浴5 min，冷卻后定容至25 mL，分光光度計540 nm下測OD值（m2）。m1-m2=A，酶活力(μmol/mL)=A×1 000/2[3]。

1.5 不同發(fā)酵劑對核桃青皮的降解效果研究

使用三角瓶固體發(fā)酵的方法研究不同發(fā)酵劑對核桃青皮的降解效果。配好的核桃青皮降解率測定培養(yǎng)基分裝在6個250 mL三角瓶里，每瓶加入發(fā)酵劑0.1 g，以不加發(fā)酵劑為對照，混勻后置于50℃恒溫箱培養(yǎng)，10 d后測定其降解率。用無菌蒸餾水洗去可溶部分，過濾，將剩余物置于105℃烘箱中烘至恒重，用分析天平分別稱重記為M（g），降解率=（M-5）/5×100%。

2 結果與分析

2.1 濾紙條崩解試驗pH變化及接代數(shù)情況

由表1可以看出，1號和3號的pH一直增大，而2號的pH先減小后增大，4號（青皮腐解物）和5號（森林土壤）的pH先增大后減小。

表1 濾紙條崩解試驗pH變化情況

由表2可以看出，2號發(fā)酵劑對濾紙條崩解見效快，但是持續(xù)繁殖能力較弱，而1號發(fā)酵劑能夠轉接15代，持續(xù)98 d對濾紙條具有分解效果，說明1號發(fā)酵劑對纖維素的降解效果較好。

表2 濾紙條崩解試驗轉接代數(shù)情況

2.2 標準曲線測定

采用DNS還原法測定還原糖量[4]，以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，作葡萄糖標準曲線（圖1）。

圖1 葡萄糖標準曲線

通過擬合得葡萄糖標準曲線為：y=0.521x+0.004 3（R2=0.994 3），其中y表示吸光度（A），x表示葡萄糖濃度（mg/mL）。

2.3 不同降解劑作用下的纖維素酶活性

由表3可知，1號發(fā)酵劑的酶活性較高，在11 d時達到67.0 U/mL，說明其降解纖維素效果最好，而2號和3號發(fā)酵劑次之，4號和5號樣品對纖維素的降解效果較差。

表3 不同降解劑作用下的纖維素酶活性 U/mL

2.4 不同發(fā)酵劑對核桃青皮的降解率

由表4可知，1號發(fā)酵劑對核桃青皮的降解效果較好，在10 d時可以達到25.5%，而2號和3號降解效果次之，這與其對纖維素的降解效果一致。

表4 不同發(fā)酵劑對核桃青皮的降解效果

3 結論與討論

根據(jù)濾紙條崩解試驗、纖維素酶活測定以及核桃青皮降解效果研究可知，1號微生物發(fā)酵劑（由地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌等組成）對核桃青皮的降解效果最好，可以作為核桃青皮降解處理的首選制劑。核桃青皮作為農(nóng)業(yè)廢棄物，如果隨意堆放，既污染環(huán)境，又造成浪費，用發(fā)酵劑合理發(fā)酵后作為肥料回田，可以減少污染，使資源得以循環(huán)利用。該研究為核桃青皮的開發(fā)利用提供了一定依據(jù)。