王 榮，羅 倩，馮 怡

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

山奈酚是一類從蔬菜水果及中藥材中提取得到的黃酮醇類物質(zhì)，其具有抗氧化、抗癌、防治糖尿病、保護損傷細胞等多種功能[1]。研究顯示，山奈酚具有較強的抗氧化活性，可作為抗氧化劑添加在藥物中。已有文獻報道山奈酚能夠通過清除活性氧、保護抗氧化酶的活性抑制活性氧誘發(fā)人紅細胞的溶血[2]。但目前未有實驗評估山奈酚對自由基的清除活性及其總抗氧化能力。

目前對抗氧化物質(zhì)的體外活性評價方法主要有自由基(DPPH自由基、ABTS自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等)清除實驗，脂質(zhì)過氧化抑制實驗和總抗氧化能力的測定等評價方法。本實驗基于酶標儀-微孔板，建立微量DPPH自由基清除、ABTS自由基清除和總抗氧化能力測定法，從以上三個方面驗證山奈酚的體外抗氧化作用，為其作用抗氧化劑的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

山奈酚標準品(含量95.5%，批號110861-201611)，中國食品藥品檢定研究院；抗壞血酸(Vc)(純度99%)，北京索萊寶科技有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基)(純度97%)，上海思域化工科技有限公司；ABTS([2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽])(純度98%)，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)測試盒，南京建成生物工程研究所；無水乙醇，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

1.2 儀 器

全波長酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；分析天平，奧豪斯儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 DPPH·清除能力的測定

2.1.1 DPPH·標準曲線的繪制

避光稱取DPPH粉末82 mg，無水乙醇定容于50 mL量瓶中，得1.64 mg/mL的DPPH母液。以無水乙醇為溶劑將上述母液稀釋至0.0615、0.05125、0.041、0.03075、0.0205 mg/mL。517 nm處測定其吸光度，以濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制DPPH標準曲線。結(jié)果DPPH溶液在0.0205～0.0615 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y=11.4156x+0.1717，相關(guān)系數(shù)R2=0.9945。

2.1.2 山奈酚對DPPH·清除能力

稱取適量山奈酚，加入無水乙醇配制成濃度為160 μmol/L的溶液，后用無水乙醇稀釋成濃度梯度為160、80、40、20、10、5、2.5 μmol/L的溶液。精密吸取梯度樣品溶液100 μL和0.1 mmol/L的DPPH溶液100 μL為實驗組，對照組用100 μL無水乙醇代替DPPH溶液，以加入100 μL DPPH溶液和100 μL無水乙醇為標準組，避光反應(yīng)30 min，之后用酶標儀在517 nm下測定吸光度。以Vc為對照。以上實驗重復(fù)三次。由式(1)計算清除率，計算IC50值:

DPPH清除率=[1-(A實驗組-A對照組)/A標準組]×100%

(1)

Vc和山奈酚對DPPH自由基的清除率與濃度呈正相關(guān)。IC50的數(shù)值可衡量被測抗氧化劑的半抑制濃度。IC50值越小，表明抗氧化活性越強。山奈酚的濃度為20 μmol/L時，清除率達47.86%，濃度為80 μmol/L時，清除率則高達88.83%，其IC50為16.17 μmol/L。Vc的清除能力較強，在濃度約為56 μmol/L時清除率就可達93.63%，Vc的IC50為9.57 μmol/L。顯示山奈酚對DPPH自由基有一定的清除能力。

2.2 ABTS·清除能力的測定

避光稱取ABTS自由基粉末30 mg，加超純水8 mL溶解，得7.0 mmol/L的ABTS水溶液。秤取10 mg K2S2O8加15 mL超純水溶解，將以上二種溶液按體積比1：1等量混合，制備ABTS·+母液，置于4 ℃冰箱保存10～12 h，備用。使用時，用無水乙醇稀釋至吸光度在0.7±0.02 Abs范圍內(nèi)即可。配制30 μmol/L山奈酚溶液，無水乙醇稀釋成濃度梯度分別為30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375 μmol/L的溶液。精密吸取梯度樣品溶液100 μL和ABTS水溶液100 μL為實驗組，對照組用100 μL無水乙醇代替ABTS水溶液，以加入100 μL ABTS水溶液和100 μL無水乙醇為標準組，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。避光反應(yīng)30 min，之后用酶標儀在734 nm下測定吸光度。以Vc為對照。以上實驗重復(fù)三次。由式(2)計算清除率，計算IC50值。

ABTS清除率=1-[(A實驗組-A對照組)/A標準組]×100%

(2)

ABTS在氧化劑過硫酸鉀作用下被氧化成綠色的陽離子自由基ABTS·+，在抗氧化劑存在時，ABTS·+的產(chǎn)生會被抑制，從而使反應(yīng)體系顏色變淺，在734 nm處所測吸光度值變小，通過測定吸光度值的變化即可判斷樣品抗氧化能力的大小。Vc與山奈酚對ABTS自由基清除率與濃度均呈正相關(guān)，當濃度為15 μmol/L時，清除率可達54.25%，濃度為30 μmol/L時，清除率可高達90.12%，山奈酚的IC50為6.97 μmol/L。而Vc的濃度約為56 μmol/L時，清除率為99.84%，Vc的IC50為6.78 μmol/L，山奈酚對ABTS自由基具有較好的清除能力。

2.3 總抗氧化能力(FRAP法)的測定

2.3.1 FeSO4-7H2O標準曲線的繪制

精密稱取27.8 mg FeSO4-7H2O標準品，超純水溶解定容至1 mL，得濃度為100 mmol/L的母液，以水為溶劑將上述母液稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。593 nm處測吸光度，以吸光度值為橫坐標，對應(yīng)的標準品濃度為縱坐標制成FeSO4-7H2O標準曲線。結(jié)果表明，F(xiàn)eSO4-7H2O溶液在0.15～1.5 mmol/L范圍內(nèi)，其濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其方程為y=3.5563x+0.1898，其相關(guān)系數(shù)R2=0.991。

2.3.2 山奈酚的總抗氧化能力

避光稱取山奈酚標準品適量，配制濃度為5 mmol/L的山奈酚乙醇溶液，后用無水乙醇稀釋成濃度梯度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.625 μmol/L的溶液。測定以上樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線求得與標準品相同吸光度值下的樣品濃度。山奈酚的總抗氧化能力用標準物質(zhì)FeSO4溶液的濃度來表示。

表1顯示了不同濃度的山奈酚的總抗氧化能力。結(jié)果表明隨山奈酚溶液濃度增大其總抗氧化能力增大。當山奈酚濃度在15.625～62.5 μmol/L時，其總抗氧化能力差異較小。當山奈酚濃度在125～500 μmol/L時，其總抗氧化能力顯著提高。

表1 山奈酚的總抗氧化能力

3 結(jié) 論

本研究分別建立了微量化DPPH自由基清除能力測定法、ABTS自由基清除能力測定法和鐵離子還原/抗氧化力測定法(FRAP)評價山奈酚的體外抗氧化活性[3]。該方法建立在酶標儀和微孔板基礎(chǔ)之上，微孔板的使用可大幅降低試劑的消耗，酶標儀可在短時間內(nèi)快速同時測定樣本，顯著縮短了實驗周期[4-6]，該方法具有微量化、快速、準確性好等特點。

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基是一種以氮為中心的穩(wěn)定有機自由基，它的穩(wěn)定性來源于三個苯環(huán)的空間障礙和共振穩(wěn)定作用，使夾在中間的氮原子上未成對電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對效應(yīng)。其乙醇溶液顯紫色，在517 nm處有最大吸收峰，當有抗氧化劑存在時，孤電子被配對，DPPH自由基溶液的顏色變淺，吸光度值變小，根據(jù)吸光度的變化可測得抗氧化劑的清除能力[7]。ABTS[2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]自由基在適當?shù)难趸瘎?過硫酸鉀、重鉻酸鉀等)作用下氧化成綠色的自由基陽離子ABTS·+，當有抗氧化物質(zhì)存在時，ABTS·+的產(chǎn)生會被抑制，使反應(yīng)體系褪色，吸光度值變小，在734 nm處測定吸光度即可計算出藥物的清除能力[8]。總抗氧化能力的測定，利用“FRAP”法，在酸性條件下，抗氧化劑與Fe3+-TPTZ反應(yīng)，使其還原成藍色的Fe2+-TPTZ，在593 nm處測定吸光度，可以計算出抗氧化物質(zhì)的總抗氧化能力[5,9]。以上評價方法均選用VC進行對照，從而來評價山奈酚抗氧化活性的強弱。本研究結(jié)果顯示，山奈酚

對DPPH自由基和ABTS自由基具有良好的清除作用，其IC50分別為16.17 和6.97 μmol/L，山奈酚對DPPH自由基的清除作用弱于陽性藥VC(P<0.05)，但其對ABTS自由基的清除作用與VC相當(P>0.05)；500 μmol/L山奈酚的總抗氧化能力為1.04 mmol/L。以上表明山奈酚具有一定的體外抗氧化能力。