河北中醫(yī)學(xué)院 河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

何 蓮 杜澍金 曹 璨 范麗潔 賀 明 陳景偉 張 宇(石家莊 050200)

提要 目的：研究補(bǔ)腎法(補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方)對控制性超促排卵(COH)小鼠圍著床期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，探討其提高子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)小鼠建立COH模型并給予補(bǔ)腎干預(yù)，觀察小鼠妊娠數(shù)和胚胎種植數(shù)，于孕4 d取子宮，Western blot和實(shí)時定量PCR分析子宮組織中雌激素受體(ERα)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的表達(dá)變化；組織免疫熒光觀察ERα和GRP78在子宮內(nèi)膜的分布。結(jié)果：模型組小鼠妊娠數(shù)、胚胎種植數(shù)顯著低于正常組(P<0.05)；模型組小鼠ERα和GRP78在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，且ERα的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，GRP78的表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。與模型組相比，給予補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方干預(yù)后，小鼠妊娠數(shù)、胚胎種植數(shù)明顯增高(P<0.05)；ERα的mRNA和蛋白水平明顯增高(P<0.05)，GRP78的mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：補(bǔ)腎法(補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方)改善COH小鼠子宮內(nèi)膜容受性，與促進(jìn)ERα表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

體外授精(IVF)是目前治療不孕癥的主要手段，但每次胚胎移植的妊娠率仍然較低，僅占20%～30%。究其原因，1/3是卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎內(nèi)在缺陷，2/3在于子宮內(nèi)膜容受性不良。故提高子宮內(nèi)膜容受性已成為胚胎成功著床的關(guān)鍵因素[1-2]。

研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎法中的補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方具有增加子宮內(nèi)膜厚度、提高子宮內(nèi)膜容受性的作用[3-4]。建立控制性超促排卵(COH)模型并給予補(bǔ)腎干預(yù)，觀察補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對子宮雌激素受體(ERα)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)表達(dá)的影響，探討補(bǔ)腎法改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，提高子宮內(nèi)膜容受性的可能機(jī)制。這對于揭示中醫(yī)“腎主生殖”的理論內(nèi)涵，探索中醫(yī)調(diào)經(jīng)種子的作用機(jī)制意義重大。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8～10周齡雌性昆明系小鼠60只，健康未孕，清潔級，體質(zhì)量為25～30 g；雄性昆明系成年小鼠30只，體質(zhì)量為30～35 g。購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境中，環(huán)境溫度23℃～25℃，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 主要藥物 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方組成：山茱萸15 g，山藥12 g，熟地黃20 g，枸杞子12 g，紫河車10 g，菟絲子12 g，淫羊藿10 g，女貞子9 g，覆盆子、當(dāng)歸各10 g，香附6 g，白芍9 g，丹參10 g等。均購自河北中醫(yī)學(xué)院國醫(yī)堂藥房，制成1.5 g生藥/mL精致混懸液。

1.3 主要試劑 尿促性腺激素(HMG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)(麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司)，促性腺激素釋放激素類似物(GnRHa)(YZ-140667-20 mg, 北京索萊寶科技有限公司)。ERα抗體(sc-71064, Santa Cruz)；GAPDH抗體(10494-1-AP, Proteintech)；GRP78抗體(ab108615, Abcam)；HRP鼠二抗(sc-516102, Santa Cruz)；熒光二抗(SA0008-2, Proteintech)；Total RNA Kit Ⅱ(R6934-01, OMEGA)；M-MLV (H-) Reverse Transcriptase(R021-01, Vazyme)；SYBR qPCR Master Mix(Q311-02, Vazyme)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物模型建立 按照參考文獻(xiàn)[5]復(fù)制COH模型。將60只成年雌性小鼠行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查2個動情周期，于動情后期開始對周期規(guī)律者用藥。每日9:00腹腔注射GnRHa(40 IU/100 g)，連續(xù)9 d，1次/d；第9 d同時注射HMG(400 IU/kg)，第11 d 9:00注射hCG(100 IU/100 g)，COH造模完成。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組與用藥 將60只8～10周齡雌性昆明系小鼠分為正常組、模型組、補(bǔ)腎組3組,每組20只。補(bǔ)腎組造模同時灌胃補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方0.4 mL，1次/d；正常組每日腹腔注射/灌胃等量蒸餾水；第11 d(D11)(注射hCG日)16:00，將各組小鼠按雌∶雄=2∶1合籠，次日早晨發(fā)現(xiàn)陰栓者記為妊娠第1 d(D1)。

2.2 標(biāo)本采集與處理 于妊娠第4 d(D4)取子宮，生理鹽水沖洗干凈，截取一部分用4%多聚甲醛固定(用于組織免疫熒光)，另一部分立即置于液氮內(nèi)，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存(用于Western blot和實(shí)時熒光定量PCR)。各組剩余小鼠于妊娠第8 d(D8)計(jì)數(shù)胚胎種植數(shù)。

2.3 檢測

2.3.1 組織免疫熒光染色：取小鼠子宮組織的石蠟切片，經(jīng)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，10%山羊血清室溫孵育30 min，4℃過夜封閉一抗：ERα抗體(1∶50稀釋)、GRP78抗體(1∶50稀釋)。第2 d，PBS洗片，熒光二抗孵育1 h，DAPI孵育10 min，封片。最后利用Leica公司SP8激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

2.3.2 實(shí)時定量PCR：取子宮組織剪碎，加入TRIZOL試劑組織勻漿管勻漿，提取總RNA。利用試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，按SYBR qPCR Master Mix使用說明書進(jìn)行PCR。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA的相對表達(dá)量。所用引物序列如表1。

表1 所用引物序列

2.3.3 Western blot分析：提取子宮組織蛋白液，與5×上樣緩沖液混勻，變性處理后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜，并用5%牛奶37℃封閉2 h。TTBS洗膜后，一抗(Anti-ERα和Anti-GRP78均1∶500稀釋)孵育，4℃過夜。第2 d洗膜后，二抗(1∶20 000稀釋)室溫孵育2 h，洗膜。利用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(LAS 4000，美國GE公司)曝光顯影，檢測抗體特異性結(jié)合條帶。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠妊娠率及胚胎種植數(shù) 與正常組相比，模型組妊娠率和胚胎種植數(shù)均明顯降低(P<0.05)；與COH模型組相比，補(bǔ)腎組妊娠率和胚胎種植率均明顯增高(P<0.05)，但與正常組差異無顯著性(P>0.05)。詳見表2。

3.2 各組小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜ERα及GRP78蛋白變化 ERα在子宮內(nèi)膜腔上皮、腺上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及微血管中均有表達(dá)。與正常組相比，模型組子宮內(nèi)膜ERα的表達(dá)明顯降低，而GRP78明顯增高。補(bǔ)腎組子宮內(nèi)膜ERα的表達(dá)明顯增高，而GRP78明顯降低，與正常組差異無顯著性(P>0.05)。見圖1。

表2 各組小鼠的妊娠數(shù)和胚胎種植數(shù)比較

注：M 模型組；BS 補(bǔ)腎組；Merge(ERα與DAPI、GRP78與DAPI的組合)。

3.3 各組小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜ERα及GRP78 mRNA的表達(dá) 模型組中ERα mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，GRP78 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)。而補(bǔ)腎組中ERα表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)，GRP78表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05)，ERα和GRP78表達(dá)與正常組差異無顯著性(P>0.05)。見圖2。

3.4 各組小鼠種植窗期子宮內(nèi)膜ERα及GRP78蛋白的表達(dá) 檢測各組小鼠子宮內(nèi)膜中蛋白表達(dá)水平，模型組ERα明顯降低(P<0.05)，GRP78明顯增高(P<0.05)。而補(bǔ)腎組中ERα明顯高于模型組(P<0.05)，GRP78明顯低于模型組(P<0.05)，ERα和GRP78蛋白表達(dá)與正常組差異無顯著性(P>0.05)。見圖3。

注：與正常組(Con)相比，*P<0.05；與模型組(M)相比，#P<0.05。

注：A. Western blot條帶結(jié)果。B. 相對灰度值。與正常組(Con)相比，*P<0.05；與模型組(M)相比，#P<0.05。

4 討論

IVF-ET輔助生殖技術(shù)日益成熟，在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用?？刂菩猿倥怕咽荌VF-ET過程中的重要環(huán)節(jié)，盡管可以通過控制性超促排卵獲取多個卵子，但是胚胎種植的妊娠率仍較低。胚胎的成功植入需要高質(zhì)量的胚胎、容受性好的子宮以及胚胎和內(nèi)膜之間一系列的緊密調(diào)節(jié)作用。其中，如何改善子宮內(nèi)膜容受性一直是生殖醫(yī)學(xué)研究人員關(guān)注的重點(diǎn)問題。

中醫(yī)認(rèn)為，腎藏精，主生殖。《素問·六節(jié)藏象論》曰：“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也?！盵6]胎元進(jìn)入胞宮之后，腎即行使其封藏功能，腎精充盈，氣血充足則子宮內(nèi)膜有所養(yǎng)而表現(xiàn)出最大容受能力，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所說的胚胎著床以及子宮內(nèi)膜容受性不謀而合。中醫(yī)認(rèn)為，腎精充足、腎氣旺盛子宮內(nèi)膜得以生長。反之，若腎氣虛弱、腎精不足則男女之精無以植入胞宮。因此，腎虛是子宮內(nèi)膜容受不良的主要病機(jī)。臨床上補(bǔ)腎法/補(bǔ)腎活血法是治療不孕癥的常用方法，且療效肯定。補(bǔ)腎中藥可以增加子宮內(nèi)膜厚度，改善子宮內(nèi)膜形態(tài)，增加子宮血流，進(jìn)而改善子宮內(nèi)膜容受性，提高臨床妊娠率[7-8]。對于腎氣陰虛的患者，連方等[9]臨床研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方二至天癸顆?？梢詼p少子宮內(nèi)膜局部T淋巴細(xì)胞數(shù)量，從而提高妊娠率。腎虛，運(yùn)化無力可致瘀血內(nèi)阻于胞宮，從而引起不孕。補(bǔ)腎活血法可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜標(biāo)志物HOXA10、HOXA11、血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達(dá)、MVD和LIF表達(dá)，證實(shí)該法可以改善子宮內(nèi)環(huán)境，從而提高妊娠率[10-12]。本研究建立COH小鼠模型，并在模型建立過程中每日對小鼠灌胃補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方0.4 mL(等效于臨床劑量)進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)了COH明顯降低了小鼠的妊娠率和胚胎種植數(shù)，而中藥補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可以顯著提升COH小鼠的妊娠率和胚胎種植數(shù)，其治療結(jié)果與正常小鼠差異無顯著性。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)的一個精細(xì)的膜系統(tǒng)，參與分泌蛋白和跨膜蛋白的合成、折疊、成熟和翻譯后修飾等[13]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肌體的多種疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，其機(jī)制均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[14]。當(dāng)一些應(yīng)激刺激(如缺氧、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)缺乏、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等)干擾了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能時，未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積聚，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)[15-16]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，不能正確折疊的蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過強(qiáng)或持續(xù)時間過久，可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞凋亡[17-18]。筆者推測，由于氧化應(yīng)激、缺氧、營養(yǎng)缺乏、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等微環(huán)境異常誘發(fā)子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜凋亡，血供減少，形態(tài)上表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜薄、功能上表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜功能不完全，致使子宮內(nèi)膜容受性低，胚胎著床率低。研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78表達(dá)，表明補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可以改善子宮微環(huán)境異常時所導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少子宮內(nèi)膜凋亡、血供減少等子宮內(nèi)膜功能不良情況的出現(xiàn)。

ERα是屬于甾體激素受體家族的重要成員，廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞、毛細(xì)血管外膜細(xì)胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞等[19]，COH過程中，ERα提前下降，基質(zhì)細(xì)胞和腺細(xì)胞不同步發(fā)育，基質(zhì)細(xì)胞提前蛻膜化，子宮內(nèi)膜容受性下降[20-21]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可以促進(jìn)COH小鼠中ERα表達(dá)，因此推測補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可能通過提高ERα水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)GRP78的表達(dá)，以達(dá)到改善子宮內(nèi)膜厚度及血供、維護(hù)子宮內(nèi)膜功能完整性的目的。其具體機(jī)制及相關(guān)信號通路，還尚待進(jìn)一步研究。