河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研究中心

王瑞龍 王 茜 張睦清△ 韓 雪 郝 蕾 張一昕 (石家莊 050200)

提要 目的：通過檢測大鼠血清肝功能指標和肝組織磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、原癌基因(c-jun)、即早基因(c-fos)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)蛋白的表達，觀察錦燈籠對對乙酰氨基酚(APAP)所致藥物性肝損傷(DILI)大鼠的干預(yù)作用及機制。方法：將50只wistar大鼠稱重后隨機分5組，正常組、模型組、陽性藥(水飛薊賓)對照組以及錦燈籠高、低劑量組。給予各用藥組相應(yīng)藥液灌胃給藥同時，正常組與模型組則灌飼蒸餾水，共計30 d。實驗結(jié)束時，用生化分析儀檢測血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性；用Western-Blot技術(shù)檢測肝組織中p-JNK的蛋白表達情況；用免疫組化法觀察c-jun、c-fos、HMGB1蛋白表達。結(jié)果：錦燈籠高、低2個劑量組皆能明顯地降低模型大鼠的AST、ALT活性及DBIL、TBIL 的含量(P<0.05，P<0.01)，不同程度下調(diào)c-jun、c-fos、HMGB1、p-JNK蛋白表達(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：錦燈籠各劑量組對DILI大鼠有明顯的保護作用，其作用機制可能與抑制c-fos、c-jun 、HMGB1及p-JNK蛋白的表達有關(guān)，對APAP所致肝損傷起到保護作用。

對乙酰氨基酚(APAP)是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，但因治療感冒的多種復(fù)方制劑中均含有APAP，導(dǎo)致公眾在自行購買感冒藥治療疾病時造成無意識的APAP使用過量，從而造成不同程度的肝損傷。目前臨床治療APAP過量，主要是在中毒早期使用N-乙酰半胱氨酸，但如果不能及時發(fā)現(xiàn)藥物中毒則解毒劑的效果就會降低[1]。因此，探尋能夠早期診斷APAP肝毒性的生物標志物，基于中醫(yī)藥理論研發(fā)具有護肝作用的中藥新藥，對于臨床防治藥物性肝損傷(DILI)意義重大。

錦燈籠為茄科的多年生草本植物酸漿，用藥部位為其干燥的宿萼以及帶有果實宿萼，味苦，性寒，歸肺經(jīng)，功效清熱解毒、利咽化痰、利尿通淋。傳統(tǒng)常用于治療咽痛音啞，痰熱咳嗽，小便不利，熱淋澀痛等病證[2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，錦燈籠不僅具有抗炎、利尿、抗氧化、護肝等藥理作用，且臨床醫(yī)家常重用錦燈籠治療肝炎[3-7]?；谥嗅t(yī)認為DILI由濕熱毒瘀所致的病機特點，筆者認為錦燈籠可通過清熱解毒、利水除濕的功效，祛除DILI濕熱毒瘀之邪，從而達到護肝的目的。為了進一步探討其防治DILI作用機制，為研發(fā)護肝新藥提供依據(jù)，本文擬通過檢測肝功能指標以及在診斷APAP過量引起的肝損傷方面更靈敏的高遷移率族蛋白1(HMGB1)蛋白表達情況，揭示其護肝療效，通過檢測在APAP誘導(dǎo)的肝損傷中發(fā)揮重要作用的c-Jun氨基末端激酶(JNK)、原癌基因(c-jun)和即早基因(c-fos)蛋白表達的情況，探討錦燈籠基于JNK/c-jun/c-fos通路的保肝作用機制[8-13]。

1 材料

1.1 藥物 錦燈籠采用現(xiàn)代中藥制劑，四川新綠色藥業(yè)公司加工生產(chǎn)的固體配方顆粒。水飛薊賓膠囊(每片含35 mg，批號為750709172)，產(chǎn)自天津的天士力勝特藥業(yè)公司。APAP片(每片含0.5 g，批號016171002)由石藥集團歐意藥業(yè)有限公司提供。

1.2 動物 清潔級別的wistar品系大鼠58只，體質(zhì)量(175～215)g，雌雄各半，北京維通利華生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.3 試劑 谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(批號分別為AUZ3651、AUZ3687)，貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)有限公司；總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)試劑盒(批號分別為A005、A006)，長春匯力生物技術(shù)有限公司；P-JNK兔單抗(Tyr185)，Cell Signaling Technology公司；β-actin小鼠單抗(批號17AV0431)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)批號136079)、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(批號135472)、c-Fos的兔多抗(批號00058736)、c-jun兔多抗(批號GR156116-1)和高遷移率族蛋白B1的一抗皆購自于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；二抗(goat，批號K186871A)，DAB(批號K187815P)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 半自動生化儀(Humalyzer2000，德國豪邁)；顯微圖像分析系統(tǒng)(HMIAS-2000，武漢同濟醫(yī)科大學(xué))；電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)；Tanon Gis電泳圖像分析系統(tǒng)(Tanon1600)；Quantity one分析軟件(Bio-Rad Technical Service Department)等。

2 方法

2.1 分組與給藥 實驗時將大鼠按體質(zhì)量隨機分為正常組、模型組、陽性藥(水飛薊賓)對照組、錦燈籠高、低劑量組(用量分別為6.67 g生藥/kg，1.673 g生藥/kg)5組，其中正常組10只，其余每組各12只，雌雄各半。參考文獻進行造模給藥[14]。給予各用藥組相應(yīng)藥液灌胃同時，正常組與模型組則灌飼蒸餾水，連續(xù)給藥30 d。

2.2 標本制備 實驗結(jié)束時，3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，股動脈取血，4 000 r/min，離心10 min，分離血清。取血后迅速剖開腹腔將取最大葉固定部位肝組織分成2份，分別用4%多聚甲醛液固定及凍存管液氮凍存。

2.3 血清樣本檢測 按照試劑盒說明書用比色法和檢測血清AST、ALT活性，用膽紅素氧化酶法測定TBIL、DBIL含量。

2.4 肝組織病理形態(tài)觀察 取4%多聚甲醛溶液固定的肝臟組織，進行常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.5 肝組織p-JNK蛋白表達檢測 采用Western blot法，用蛋白裂解液裂解肝組織，離心，100℃中煮沸5 min。變性，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，一抗稀釋1 000倍，4℃反應(yīng)過夜，洗滌3次，二抗稀釋3 000 倍，孵育60 min，洗滌，顯色，曝光，洗片，分析。

2.6 肝組織c-jun、c-fos、HMGB1蛋白的免疫組化檢測 常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后，通過脫蠟、復(fù)水、甲醇雙氧水孵育、滴加一抗、二抗、化學(xué)反應(yīng)顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、二甲苯透明、封片等步驟觀察c-jun、c-fos、HMGB1蛋白表達，用陽性反應(yīng)物相對含量的積分光密度值(IOD)和平均光密度值(MOD)表示蛋白表達強弱。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 全部數(shù)據(jù)均運用SPSS21.0分析統(tǒng)計軟件處理，根據(jù)數(shù)據(jù)類型本實驗數(shù)據(jù)主要是計量資料，其差異的比較運用方差分析法，多個組間的差異比較則運用Dunnett；以P<0.05為統(tǒng)計分析差異具有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 錦燈籠對APAP肝損傷大鼠肝功能指標的影響 與正常組比較，模型組大鼠ALT活性、AST活性及 DBIL、TBIL 的含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，水飛薊賓和錦燈籠各劑量組ALT、AST活性及 DBIL、TBIL 的含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠肝功能指標的比較

3.2 錦燈籠對APAP肝損傷大鼠肝臟HMGB1蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠的肝組織HMGB1蛋白表達顯著升高(P<0.01)；錦燈籠高、低劑量組均能顯著下調(diào)肝損傷大鼠的HMGB1蛋白表達(P<0.01，P<0.05)；與水飛薊賓組比較，錦燈籠高、低劑量組能顯著上調(diào)HMGB1蛋白表達(P<0.01)。詳見表2、圖1。

表2 各組大鼠肝組織HMGB1蛋白表達的比較

注：A 正常組；B 模型組；C 水飛薊賓組；D 高劑量組；E 低劑量組。

3.3 錦燈籠對APAP肝損傷大鼠p-JNK蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組p-JNK蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，錦燈籠各劑量組p-JNK蛋白表達顯著降低(P<0.01，P<0.05)。詳見表3、圖2。

表3 各組大鼠肝組織p-JNK蛋白表達情況

注：A 正常組；B 模型組；C 水飛薊賓組；D 高劑量組；E 低劑量組。

3.4 錦燈籠對APAP肝損傷大鼠c-jun、c-fos蛋白的表達變化的影響 對比正常組，模型組大鼠肝組織中c-jun、c-fos 2種蛋白的表達均有明顯升高(P<0.01)；對比模型組，陽性藥水飛薊賓對照組與各劑量組c-jun、c-fos蛋白表達均有明顯的降低(P<0.01)；錦燈籠高、低劑量組c-jun蛋白MOD值較水飛薊賓組顯著降低(P<0.05)，低劑量組c-fos蛋白IOD值較水飛薊賓組和高劑量組顯著升高(P<0.01)。詳見表4、圖3、圖4。

表4 各組大鼠肝組織c-jun、c-fos蛋白表達的比較

注：A 正常組；B 模型組；C 水飛薊賓組；D 高劑量組；E 低劑量組。

注：A 正常組；B 模型組；C 水飛薊賓組；D 高劑量組；E 低劑量組。

4 討論

隨著人們生活方式的改變，現(xiàn)代疾病譜也發(fā)生了很大的變化，患者常身患多種疾病，經(jīng)常需要多種藥物聯(lián)合使用，這就導(dǎo)致藥物性肝損傷的發(fā)生越來越多。但目前對于DILI的診斷多根據(jù)服藥史與肝損傷的因果關(guān)系進行定性，通過檢測血清AST、ALT、ALP(堿性磷酸酶)、膽紅素水平判斷肝損傷程度，但有些患者出現(xiàn)肝損傷時以上指標并未出現(xiàn)明顯的改變，從而延誤治療時機[15]。因此，尋找具有特異性、敏感性較高的診斷DILI 的生物標志物，是目前科研工作者普遍關(guān)注的重點問題。

研究表明，HMGB-1作為一種在真核生物細胞核內(nèi)普遍存在高度保守的蛋白質(zhì)，是APAP肝損傷血清診斷和嚴重程度評估的敏感生物標志物[16]。有學(xué)者對服用APAP過量的患者血漿進行檢測，發(fā)現(xiàn)無論患者血漿ALT活性是否升高，HMGB-1水平均能有效識別肝損傷[17]。美國聯(lián)盟臨床研究結(jié)果也表明，乙?；疕MGB1水平可準確判斷DILI恢復(fù)良好、發(fā)展為慢性和預(yù)后不良3種情況[18]。實驗結(jié)果顯示，模型組ALT、AST活性及 DBIL、TBIL 的含量顯著升高，提示肝損傷模型建立成功；水飛薊賓組和錦燈籠高、低劑量組均能顯著降低ALT、AST含活性及 DBIL、TBIL 的含量。高、低劑量組均能顯著下調(diào)HMGB1的蛋白表達，提示錦燈籠對藥物性肝損傷有一定的防治作用。

目前APAP導(dǎo)致肝損傷的機制已經(jīng)比較明確，主要是因為其服用過量之后在體內(nèi)產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物N-乙酰對苯醌亞胺耗竭還原性谷胱甘肽，從而生成大量的活性氧，加重線粒體損傷，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，引起氧化應(yīng)激，激活JNK，導(dǎo)致肝細胞損傷[19-21]。另有研究表明，JNK介導(dǎo)的信號通路的活化及沉默對于肝細胞的存活—死亡—分化—增殖以及腫瘤的罹患、病情發(fā)展都有較為密切的關(guān)系，當(dāng)APAP接觸肝細胞后激活JNK，可引起線粒體外膜通透性變化導(dǎo)致細胞凋亡[22-23]；另一方面，激活過氧化物酶體增殖物激活受體 α( PPARα) 可以抑制 JNK的磷酸化，進而控制其下游的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如 c-Jun 和c-fos等的表達，促使線粒體中活性氧的含量下降，谷胱甘肽的含量增加，修復(fù)線粒體損傷，增強抗氧化應(yīng)激能力，最終達到減輕APAP所致肝損傷的目的[24]。實驗結(jié)果顯示，錦燈籠高、低劑量組均能顯著下調(diào)c-jun、c-fos、HMGB1及p-JNK蛋白表達，提示錦燈籠通過抑制c-fos、c-jun、HMGB1及p-JNK的表達發(fā)揮對APAP所致肝損傷起到早期干預(yù)保護作用的目的。