盧陽 陳萍 林素仙 姜建昌 王勝男 張智勇 楊美綠
類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的免疫性疾病。機體免疫系統(tǒng)改變,特別是細胞免疫異常,在RA發(fā)生過程中所起的關(guān)鍵性作用越來越受到重視[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn),在RA患者外周調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)的比例明顯下降,且存在以分泌IL-17為特征的CD4+T細胞(Th17)細胞增殖,這種Th17/Treg失衡是導(dǎo)致RA炎癥和損傷的重要因素[3-4]。既往研究發(fā)現(xiàn),生長停滯特異性蛋白 6(growth arrest-specific 6,Gas6)能促進Treg功能活化(呈濃度依賴性),增強Treg對T細胞增殖的抑制能力[5-6]。此外,缺失Gas6的小鼠Th17細胞顯著增殖,呈現(xiàn)出Th17/Treg失衡的現(xiàn)象,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[7]。鑒于Treg在RA發(fā)病過程中的關(guān)鍵作用,筆者推測Gas6能夠調(diào)控RA小鼠Th17/Treg平衡,從而減輕炎癥和關(guān)節(jié)損傷,為此,筆者通過建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)小鼠模型,探討 Gas6對Th17/Treg細胞平衡和炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。
1.1 實驗動物及試劑 雄性SPF級DBA/1J小鼠24只(8周齡,體重22~25 g)購自上海斯萊克實驗動物有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2012-0002,飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。弗氏完全佐劑(F5881)和弗氏不完全佐劑(F5506)購自美國Sigma公司,牛Ⅱ型膠原蛋白購自美國Chondrex公司(20022)。重組小鼠Gas6購自美國R & D公司(CF 8310-GS-050)。IL-10 ELISA試劑盒購自上海欽誠生物科技公司(QC-IL10-Mu),IL-17 ELISA試劑盒購自聯(lián)邁生物公(LM-IL-17-Mu)。FITC標記的大鼠抗小鼠CD4抗體(553046)、PE標記大鼠抗小鼠叉頭蛋白翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子 P3(Forkhead/winged helix transcription factor p3,F(xiàn)oxp3)抗體(560414)和PE標記大鼠抗小鼠IL-17A抗體均購自美國BD公司(561020)。
1.2 實驗分組及CIA小鼠模型制備 將小鼠按照隨機數(shù)字表法分為4組,即對照組、CIA組、CIA+生理鹽水組和CIA+Gas6組,每組6只。參考文獻[8]建立動物模型。實驗遵循國際通行的動物福利和倫理準則。第1天后3組小鼠在尾根部皮下注射0.1 ml由弗氏完全佐劑與牛Ⅱ型膠原蛋白等體積(各0.05 ml)混合乳劑,第21天再次注射0.1 ml弗氏不完全佐劑與牛Ⅱ型膠原蛋白等體積(各0.05 ml)混合乳劑,構(gòu)建CIA模型。對照組以0.9%氯化鈉注射液替代牛Ⅱ型膠原蛋白。CIA+Gas6組小鼠在第2次注射后立即腹腔注射30 μg/ml的Gas6 0.1 ml,以后每3天1次,共3次,總劑量為9 μg。CIA+生理鹽水組小鼠在第2次注射后,立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.1 ml,以后每3天1次,共3次。
1.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)評分 第1次注射后42 d,對小鼠四肢進行AI評分,共分為5級。0分:正常,關(guān)節(jié)無紅腫;1分:足趾關(guān)節(jié)輕度紅腫;2分;足趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3分:踝關(guān)節(jié)以下足爪紅腫;4分:包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪均有紅腫且伴有功能障礙。每只小鼠AI評分為四肢關(guān)節(jié)評分之和,總分最高為16分。
1.4 IL-10和IL-17水平檢測 第1次注射后42 d,小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.2 ml麻醉后打開腹腔,采集下腔靜脈血1.0 ml,EDTA抗凝,2500 r/min,離心15min(4℃),取上清液,采用ELSIA試劑盒檢測IL-17和IL-10水平。
1.5 Treg和Th17細胞檢測 采用流式細胞術(shù)。下腔靜脈取血完畢后處死小鼠,留取脾臟,置于40 μm孔徑濾網(wǎng)上研磨成勻漿,用PBS重懸細胞,并調(diào)節(jié)細胞密度至1×107個/ml。等分細胞懸液,每管 50 μl,再加 50 μl流式染色緩沖液。加入抗CD4-FITC,4℃避光孵育1 h,PBS洗2次后,分別染色IL-17A和Foxp3,以檢測Th17和Treg細胞比例。Th17細胞檢測:每個樣本加入2 ml流式染色緩沖液,400 g/min離心5 min,棄上清液,每管加入流式染色緩沖液100 μl重懸細胞,并加入1 μg/ml的IL-17A抗體,室溫避光孵育1 h。Treg細胞檢測:以1 ml Foxp3 Fix/permeabilization工作液重懸細胞,輕柔震蕩,4℃避光孵育1 h后,每管加2 ml通透緩沖液,300 g/min室溫離心 5 min,棄上清液。加100 μl通透緩沖液重懸細胞后,加入抗Foxp3抗體,4℃避光孵育1 h。上機檢測前,每個樣品加2 ml流式染色緩沖液,400 g/min離心5 min,棄上清液。上述過程重復(fù)2次,每管加入流式染色緩沖液1 ml上機。
1.6 踝關(guān)節(jié)病理檢查 處死小鼠后,于雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)處截斷,去外皮和肌肉,10%中性甲醛固定48 h,采用硝酸脫鈣2 h,二甲苯浸潤后,石蠟包埋,制成切片,常規(guī)HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。
2.1 4組小鼠AI評分的比較 CIA小鼠顯示出明顯的關(guān)節(jié)腫脹,Gas6干預(yù)后,小鼠的關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕,見圖1。在造模后第42天,CIA+生理鹽水組與CIA組相比AI評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),CIA+Gas6組與CIA+生理鹽水組相比AI評分明顯下降(P<0.01),見表1。
2.2 4組小鼠踝關(guān)節(jié)病理變化的比較 病理結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組小鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常,未見顯著的炎癥細胞浸潤和軟骨破壞現(xiàn)象。CIA組小鼠踝關(guān)節(jié)可見大量炎癥細胞浸潤和嚴重的關(guān)節(jié)軟骨破壞。與CIA組小鼠相比,CIA+Gas6組小鼠踝關(guān)節(jié)炎癥細胞減少,關(guān)節(jié)軟骨破壞減輕,見圖 2(插頁)。
圖2 4組小鼠踝關(guān)節(jié)病理損傷的比較(a:對照組;b:CIA 組;c:CIA+ 生理鹽水組;d:CIA+Gas6組;HE 染色,×100)
2.3 4組小鼠IL-10、IL-17水平的比較 與對照組相比,CIA小鼠IL-10水平升高(P<0.05)。與CIA組比較,CIA+Gas6組IL-10水平較高(P<0.05)。與對照組相比,CIA組小鼠IL-17水平明顯升高(P<0.01)。與CIA組相比,CIA+Gas6組 IL-17水平明顯下降(P<0.01),見表2。
2.4 4組小鼠脾臟CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+細胞比例的比較 與對照組相比,CIA小鼠脾臟CD4+IL-17+細胞比例明顯升高,而CD4+Foxp3+細胞比例顯著下降(P<0.01)。與CIA組小鼠相比,CIA+Gas6組小鼠脾臟CD4+IL-17+細胞比例明顯下降(P<0.05),CD4+Foxp3+細胞比例顯著增加(P<0.01),見圖3和表3。
圖1 4組小鼠關(guān)節(jié)圖(a:對照組;b:CIA 組;c:CIA+生理鹽水組;d:CIA+Gas6組)
表1 4組小鼠AI評分的比較(分)
表2 4組小鼠IL-10、IL-17水平的比較(pg/ml)
RA總體發(fā)病率約為0.3%~1.5%,且晚期致殘率極高,嚴重威脅患者的身心健康[9]。已經(jīng)證實,RA關(guān)節(jié)腔和滑膜有包括T淋巴細胞、B淋巴細胞及巨噬細胞等多種免疫細胞浸潤,釋放IL、TNF和IFN等炎癥因子;此外,炎癥因子的釋放可進一步誘導(dǎo)免疫細胞聚集,形成惡性循環(huán),最終引起滑膜和關(guān)節(jié)損害[1-2]。鑒于此,靶向炎癥和免疫活化一直是RA治療學(xué)研究的重點,但迄今為止臨床上仍缺乏有效的干預(yù)策略和藥物。
TAM受體是機體重要的“炎癥開關(guān)”[5]。有研究證實,TAM受體家族缺失的小鼠,脾臟淋巴細胞大量擴增和活化,可引起機體炎癥性損傷[10]。在肥胖相關(guān)的骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)現(xiàn),阻斷TAM受體家族Axl后,關(guān)節(jié)損傷明顯加重[11]。另據(jù)報道,Axl基因缺陷的關(guān)節(jié)炎小鼠,其滑膜炎癥、骨和軟骨的破壞明顯增加[12]。Gas6是TAM家族的天然配體[5]。本研究發(fā)現(xiàn),Gas6干預(yù)后,CIA小鼠AI評分明顯下降,踝關(guān)節(jié)的病理損害也顯著減輕。上述結(jié)果提示,激活Gas6-TAM通路對于減輕RA有著重要的保護作用,但其機制尚不清楚。
CD4+T淋巴細胞是機體獲得性免疫應(yīng)答的主要細胞。在機體內(nèi)外環(huán)境的影響下,CD4+T淋巴細胞可分化為包括Treg和Th17等多種細胞亞群[3-4]。Th17細胞通過分泌IL-17,激活細胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)和核因子 κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)等炎癥信號通路,介導(dǎo)促炎因子的分泌及基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生,參與組織炎癥和組織損傷過程[8]。Treg根據(jù)其來源不同可以分為天然型和誘導(dǎo)型兩類,F(xiàn)oxp3是其共同的特征和標志分子。Treg是機體免疫耐受得以維持的核心細胞,其可以通過多重機制發(fā)揮免疫抑制效應(yīng),包括表面抑制分子和分泌免疫抑制性細胞因子IL-10等[6]。Th17/Treg失衡已經(jīng)被證實是RA 發(fā)生和發(fā)展的重要因素[3,8]。
圖3 4組小鼠脾臟CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+細胞流式圖(A:CD4+IL-17+細胞;B:CD4+Foxp3+細胞;a:對照組;b:CIA 組;c:CIA+生理鹽水組;d:CIA+Gas6組)
表3 4組小鼠脾臟CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+細胞比例的比較(%)
與既往研究類似[3,8],本研究發(fā)現(xiàn)CIA小鼠脾臟Treg比例明顯降低,而CD4+IL-17+的比例明顯升高,且外周血IL-17水平也顯著升高。Gas6干預(yù)能夠調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡,促進Treg擴增,抑制Th17的產(chǎn)生,提示Gas6對RA的治療作用可能與其對Treg/Th17平衡調(diào)控有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)RA小鼠的外周血IL-10水平也明顯增加,Gas6干預(yù)后IL-10水平進一步增加。在炎癥狀態(tài)下,包括Treg、Th2細胞以及單核細胞等均可代償性分泌IL-10。IL-10一方面可抑制炎癥反應(yīng),另一方面能通過刺激B細胞成熟,阻斷其凋亡而發(fā)揮潛在的致炎作用。鑒于IL-10已被證實能夠改善RA小鼠的關(guān)節(jié)損傷[13],IL-10可能是介導(dǎo)Gas6抗炎作用的另一重要機制。
綜上所述,Th17/Treg失衡參與了RA的致病過程。Gas6能夠促進Treg擴增,抑制Th17細胞分化,起到減輕RA關(guān)節(jié)損害的作用。然而,Gas6調(diào)控Th17/Treg平衡的機制尚不清楚,有待進一步研究。