王曉杰， 楊 科

北京市和平里醫(yī)院 急診內(nèi)科，北京 100013

急性心肌梗死是冠狀動(dòng)脈在發(fā)生閉塞、血流中斷的生理基礎(chǔ)上，部分心肌因持續(xù)性缺血，最終形成的局部壞死。有研究發(fā)現(xiàn)，STAT3蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄激活因子，其本身的蛋白表達(dá)對(duì)急性心肌梗死的病情具有一定的提示意義，STAT3蛋白亦參與許多與心肌梗死有關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控過程[1-4]。本研究旨在探討心肌STAT3蛋白表達(dá)對(duì)急性心肌梗死患者病情的評(píng)估價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2016年4月至2017年12月北京市和平里醫(yī)院收治的70例急性心肌梗死患者納入心梗組，另同期選取77例非急性心肌梗死受試者納入正常組。兩組在性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。急性心肌梗死的判定標(biāo)準(zhǔn)參照2016年歐洲心臟病學(xué)會(huì)(European Society of Cardiology，ESC)急性ST段抬高性心肌梗死治療指南[5]：(1)血清心肌標(biāo)志物肌鈣蛋白升高至少99%參考值上限。(2)冠脈造影證實(shí)冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成。(3)符合以下任意一項(xiàng)，病理性Q波形成；心肌缺血癥狀；明顯ST-T改變或新發(fā)生的左束支傳導(dǎo)阻滯；影像學(xué)證據(jù)提示有新的心肌活力喪失或新發(fā)的室壁運(yùn)動(dòng)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有心絞痛、急性心包炎、主動(dòng)脈夾層或急性肺動(dòng)脈栓塞者。(2)由于直接或間接誘因造成急腹癥者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

表1 兩組患者的基線資料比較/例(百分率/%)

1.2 研究方法 通過冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管介入抽吸(正常組僅在受試者進(jìn)入研究隊(duì)列時(shí)，心梗組則在發(fā)病時(shí)、發(fā)病后6、12、24 h分4次進(jìn)行抽吸)，加H9c2細(xì)胞原代培養(yǎng)獲取其心肌標(biāo)本。具體流程：獲得的冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管介入抽吸的血樣中添加1.0×109mmol/L枸櫞酸鈉抗凝，枸櫞酸鈉與全血的比例為1∶9，混勻后4℃暫存。將標(biāo)本以12 000 r/min離心4 min，取上清，超速離心所得微粒加入適量Trizol緩沖液，進(jìn)行充分裂解，裂解后抽提DNA，并將其轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞系(購(gòu)置上海其名生物有限公司)，于37℃、pH 7.2～7.4環(huán)境下無菌恒溫培養(yǎng)，細(xì)胞融合度>90%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代次數(shù)控制在15～20次。心肌STAT3蛋白表達(dá)測(cè)定方法[3-5]包括：(1)免疫組化法。常規(guī)石蠟經(jīng)切片、脫蠟、水化后行微波抗原修復(fù)，2.5%過氧化氫阻斷其內(nèi)源性過氧化酶，于正常血清中孵育60 min，添加相應(yīng)的一抗(LAB VISION，購(gòu)于DAKO公司)，完畢后將所有切片置于濕盒中，4℃過夜。次日取出后，加入二抗系統(tǒng)(Envision KIT)于室溫下孵育30 min，PBS溶液沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后脫水，封片。陽性對(duì)照由試劑盒提供，陰性對(duì)照則用PBS代替一抗系統(tǒng)。(2)免疫印跡法。配置15%分離膠，將凝膠固定于電泳儀上，每個(gè)電泳道的上樣量20 μg，電泳結(jié)束后將凝膠轉(zhuǎn)移至緩沖液中30 min，同時(shí)，制取聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，取3～5張濾紙浸入緩沖液中使其浸透，轉(zhuǎn)移結(jié)束后取出PVDF膜均勻震蕩，4℃過夜，次日棄置封閉液后，加入一抗和二抗于室溫下均勻震蕩60 min完成孵育過程。孵育過程結(jié)束后，室溫下TBST溶液對(duì)膜進(jìn)行沖洗，反復(fù)3次，每次3～4 min，最后采用bio-rad凝膠成像系統(tǒng)記錄最終結(jié)果。兩組STAT3蛋白表達(dá)及免疫組化結(jié)果進(jìn)行對(duì)比的過程中，由于STAT3蛋白集中于細(xì)胞核中表達(dá)，因此通過高倍鏡對(duì)石蠟切片中的代表性區(qū)域(細(xì)胞核部位棕黃色深染較密集區(qū)域，每個(gè)切片選取5個(gè)區(qū)域)進(jìn)行檢測(cè)，按照深染細(xì)胞在單位區(qū)域內(nèi)占比數(shù)目是否達(dá)到20%作為陽性和陰性判定的依據(jù)(深染細(xì)胞在單位區(qū)域內(nèi)占比數(shù)目≤20%判定為陰性，深染細(xì)胞在單位區(qū)域內(nèi)占比數(shù)目>20%判定為陽性)。

2 結(jié)果

2.1 兩組STAT3蛋白免疫組化結(jié)果比較 正常組STAT3蛋白棕黃色深染率為3.12%，心梗組STAT3蛋白在發(fā)病時(shí)、發(fā)病后6、12、24 h棕黃色深染率分別為36.00%、22.57%、22.00%、15.14%，組間及組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 心梗組STAT3蛋白表達(dá)結(jié)果(免疫組化×100；a.發(fā)病時(shí)；b.發(fā)病后6 h；c.發(fā)病后12 h；d.發(fā)病后24 h)

2.2 兩組STAT3蛋白Western blot結(jié)果比較 兩組受試者STAT3蛋白Western blot結(jié)果顯示，心梗組患者在發(fā)病時(shí)，發(fā)病后6、12、24 h測(cè)定蛋白表達(dá)量分別與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；心梗阻患者各時(shí)間段測(cè)得的蛋白表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2～3。

圖2 兩組STAT3蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果比較

圖3 免疫印跡法檢測(cè)表達(dá)量直條圖結(jié)果比較

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死患者STAT3表達(dá)量可能與G蛋白偶聯(lián)受體功能發(fā)生變化有關(guān)[1-2,6-8]。在一般情況下，G蛋白偶聯(lián)受體通過結(jié)合環(huán)境中的一些化學(xué)物質(zhì)，引起自身構(gòu)象的改變，然后再通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)招募下游因子(如效應(yīng)蛋白)繼而引起多種生物效應(yīng)，調(diào)節(jié)生物體的各項(xiàng)生理活動(dòng)。而與STAT3表達(dá)相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體的下游信號(hào)通路有多種，其中主要有兩種傳導(dǎo)信號(hào)：環(huán)狀腺苷酸途徑和磷酸化途徑[9]。對(duì)于急性心肌梗死患者，STAT3表達(dá)量可能是由于G蛋白偶聯(lián)受體受到心肌梗死特異性標(biāo)志物激活后發(fā)生自身變構(gòu)，通過串?dāng)_開放多條促使細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，發(fā)生胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的改變。STAT3可能是細(xì)胞變構(gòu)招募到的下游因子之一，通過其表達(dá)量的改變促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，心梗組患者在發(fā)病時(shí)，發(fā)病后6、12、24 h測(cè)定蛋白表達(dá)量分別與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而心梗阻患者各時(shí)間段測(cè)得的蛋白表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。心梗阻STAT3蛋白表達(dá)量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明，STAT3的表達(dá)在細(xì)胞完成凋亡程序后無明顯的時(shí)相性差異。從病理學(xué)角度，梗死是一種由于局部血液灌流受阻導(dǎo)致的細(xì)胞缺血性壞死，而壞死對(duì)于細(xì)胞而言是一個(gè)程序性過程，壞死的細(xì)胞在臨終階段其本身會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡周期的變化。有研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)梗死灶的患者，其體內(nèi)與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路將被動(dòng)激活，而這些通路的激活會(huì)影響到機(jī)體內(nèi)B細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡、細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)、細(xì)胞成分運(yùn)動(dòng)的正調(diào)控、細(xì)胞外刺激反應(yīng)以及肥大細(xì)胞脫顆粒的調(diào)節(jié)和紅細(xì)胞分化、多細(xì)胞有機(jī)體的發(fā)育、成纖維細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)氨基酸刺激反應(yīng)等分子事件的發(fā)生[10-11]。其中，B細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡可直接反映人體自身的免疫功能。另外，細(xì)胞因子是一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，其可通過結(jié)合相應(yīng)受體調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和效應(yīng)，從而調(diào)控免疫應(yīng)答。對(duì)于急性心肌梗死患者而言，良好的自身免疫功能對(duì)疾病預(yù)后的改善具有積極意義；而細(xì)胞分化在一定程度上可以提示病情惡轉(zhuǎn)的程度，低分化通常提示預(yù)后不良。因此，對(duì)這些信號(hào)通路分析的結(jié)果可以早期發(fā)現(xiàn)患者的整體病情，并結(jié)合患者自身狀況制定合理的防治方案。

綜上所述，急性心肌梗死患者STAT3蛋白表達(dá)量較高，心肌STAT3蛋白對(duì)急性心肌梗死有一定的評(píng)估作用。