黎楊浩， 徐海平， 徐細(xì)明

1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院黃梅醫(yī)院 腫瘤科，湖北 黃岡 435500；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院 腫瘤科，湖北 武漢 430061

胃癌是由胃黏膜上皮和腺上皮發(fā)生的惡性腫瘤，發(fā)病率、病死率高[1]。我國每年胃癌新發(fā)病例約40萬，占全球新發(fā)病例總數(shù)的42%[2]。目前,學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為胃癌的發(fā)生是多種環(huán)境因素和多基因共同作用的結(jié)果，其中,飲食因素(攝入含亞硝酸鹽類化合物的食物)和幽門螺桿菌感染是重要的環(huán)境因素[3-6]。幽門螺桿菌是革蘭氏陰性菌，好定居于胃黏膜。由幽門螺桿菌感染誘發(fā)的胃炎是胃癌的主要危險(xiǎn)因素[7]。有研究報(bào)道，在消除幽門螺桿菌感染后，胃癌發(fā)病率顯著降低[8]。人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)是一個(gè)原癌基因，在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。有研究報(bào)道，HER2陽性的乳腺癌、胃癌患者預(yù)后遠(yuǎn)差于HER2陰性的患者[7,9-10]。有研究報(bào)道，微小核糖核酸-146(microRNA-146，miR-146)可抑制胃癌小鼠模型中腫瘤的生長(zhǎng)[11]。目前，幽門螺桿菌與胃癌患者HER2表達(dá)相關(guān)性的研究尚無明確結(jié)論。本研究擬探討胃癌患者臨床標(biāo)本中幽門螺桿菌對(duì)miR-146、HER2表達(dá)的影響，并通過細(xì)胞研究驗(yàn)證，為胃癌的病理機(jī)制研究提供新方向?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2018年1月至2018年12月期間收治的54例胃癌患者為研究對(duì)象，通過手術(shù)取材收集胃癌組織標(biāo)本，采用快速尿素酶試驗(yàn)和細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)幽門螺桿菌感染情況。根據(jù)幽門螺桿菌感染情況將患者胃癌組織標(biāo)本分為陰性組(n=16)與陽性組(n=38)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)胃癌均為原位癌；(2)患者住院期間符合胃癌根治性切除手術(shù)指征，且同意手術(shù)治療；(3)患者無心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者同時(shí)患有除胃癌外的腫瘤性疾病；(2)未能取得患者或其家屬的知情同意。陰性組患者男性10例，女性6例；平均年齡(59.1±10.4)歲。陽性組患者男性24例，女性14例；平均年齡(55.8±12.3)歲。兩組患者性別、年齡等臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

收集胃癌患者胃癌組織標(biāo)本，實(shí)時(shí)定量聚合酶連鎖反應(yīng)檢測(cè)標(biāo)本中HER2和miR146的表達(dá)水平，免疫印記試驗(yàn)檢測(cè)HER2的蛋白表達(dá)水平。培養(yǎng)人胃腺癌細(xì)胞，加入幽門螺桿菌，并分別轉(zhuǎn)染miR-146 mimic、miR-146 inhibitor，檢測(cè)miR146被抑制前后HER2的表達(dá)。

1.2.1 細(xì)胞與試劑 幽門螺桿菌菌株NCTC11637購自ATCC，人胃腺癌細(xì)胞系購自BNCC，miRNA抽提試劑盒、miR-146a mimic、miR-146b mimic、miR-146a inhibitor、miR-146b inhibitor和陰性對(duì)照miRNA mimic均購自ambion公司，miRNA-146a、miRNA-146b特異性引物購自Qiagen公司，Lipofectamine RNAiMAX試劑盒購自Invitrogen公司，免疫印記試驗(yàn)所用抗體購自Abcam公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBER GREEN試劑盒均購自TOYOBO公司。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶連鎖反應(yīng)檢測(cè) TRIzol法抽提總RNA，用miRNA抽提試劑盒提取miRNA(檢測(cè)HER2的mRNA表達(dá)無需此步驟)，分光光度法定量，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，根據(jù)SYBR Green試劑盒進(jìn)行RT-PCR，用2-ΔΔct法分析數(shù)據(jù)。幽門螺桿菌 CagA下游引物5′-TAATGGCA TAGAACCTGA-3′，上游引物5′-CGTTGTGAGCCTGTGAGT-3′；HER2下游引物5′-CCTCTGACGTCCATCGTCTC-3′，上游引物5′-CGGATCTTCTGCTGCCGTCG-3′；GAPDH下游引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，上游引物5′-GGAAGATG GTGATGGGATT-3′。引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 免疫印記試驗(yàn)檢測(cè) 將收集的胃癌組織標(biāo)本用小剪刀剪碎，并加入液氮研磨，制成單細(xì)胞懸液，加入適量十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液100℃煮樣變性10 min，將樣品加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膠中，電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白在4℃封閉過夜，洗滌后37℃敷一抗1 h，洗滌，37℃敷二抗30 min，洗滌后顯影。

1.2.4 幽門螺桿菌感染人胃腺癌細(xì)胞 在幽門螺桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)幽門螺桿菌48 h至對(duì)數(shù)期，無菌玻棒輕輕刮下菌落收集至無菌EP管中，紫外分光光度法測(cè)定細(xì)菌濃度。培養(yǎng)人胃腺細(xì)胞系，待細(xì)胞狀態(tài)良好，密度至80%左右時(shí)，將幽門螺桿菌懸液加至細(xì)胞中，在37℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)，48 h后收獲細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 人胃腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在幽門螺桿菌感染人胃腺癌細(xì)胞24 h后，按Lipofectamine RNAiMAX試劑盒的說明書將miR-146a mimic、miR-146b mimic、miR-146a/b mimic、miR-146a inhibitor、miR-146b inhibitor、miR-146a/b inhibitor分別轉(zhuǎn)染到人胃腺癌細(xì)胞中，6 h后收獲細(xì)胞，進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者miR-146、HER2表達(dá)情況 陽性組患者HER2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較陰性組顯著上調(diào)(見圖1)，miR-146表達(dá)較陰性組顯著上調(diào)(見圖2),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽性組患者HER2的mRNA的表達(dá)水平與miR-146表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.485，P<0.05)，見圖3。

2.2 人胃腺癌細(xì)胞經(jīng)幽門螺桿菌刺激及miR-146轉(zhuǎn)染后HER2表達(dá)情況 人胃腺癌細(xì)胞經(jīng)幽門螺桿菌刺激后，HER2的mRNA及蛋白表達(dá)均較刺激前顯著上調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-146a mimic、miR-146b mimic、miR-146a/b mimic后，HER2的mRNA及蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染前顯著上調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitor、miR-146b inhibitor、miR-146a/b inhibitor后，HER2的mRNA及蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染前顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 人胃腺癌細(xì)胞經(jīng)幽門螺桿菌刺激及miR-146轉(zhuǎn)染后HER2表達(dá)情況(a.mRNA表達(dá)；b.蛋白表達(dá))

3 討論

胃癌發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，幽門螺桿菌感染是胃癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素。幽門螺桿菌定居于胃黏膜局部，其繁殖、代謝會(huì)影響局部微環(huán)境，對(duì)胃黏膜組織細(xì)胞造成負(fù)面作用。有研究報(bào)道，幽門螺桿菌感染會(huì)通過miRNA介導(dǎo)提高胃癌細(xì)胞的侵襲能力[12-13]，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移[14]。有研究表明，幽門螺桿菌可通過miRNA介導(dǎo)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞HER2表達(dá)，而HER2能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、抑制其凋亡[15]。HER2陽性的胃癌患者預(yù)后較HER2陰性患者更差[16-17]。

miRNA是一類短小的非編碼RNA，通過與基因的啟動(dòng)子區(qū)域相作用來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，可在許多腫瘤的診斷和預(yù)后中作為精確而敏感的生物指標(biāo)[18-20]。miRNA在胃癌的發(fā)病、進(jìn)展中參與許多復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程。有研究報(bào)道，miR-17可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[21]；miR-93、miR-106可抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β途徑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡[22]；miR-204則能抑制胃癌的克隆形成及轉(zhuǎn)移[23]。有研究報(bào)道，miR-146在樹突狀細(xì)胞中也有表達(dá)，并能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞凋亡[24]。說明miR-146可能有多種生理功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，陽性組患者HER2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較陰性組顯著上調(diào)，miR-146表達(dá)較陰性組顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽性組患者HER2的mRNA的表達(dá)水平與miR-146表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.485，P<0.05)。miR-146、HER2在幽門螺桿菌陽性的胃癌組織中均呈高表達(dá)。本研究將幽門螺桿菌感染的人胃腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a mimic、miR-146b mimic、miR-146a/b mimic后，HER2的mRNA及蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染前上調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitor、miR-146b inhibitor、miR-146a/b inhibitor后，HER2的mRNA及蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染前顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明miR-146可促進(jìn)幽門螺桿菌感染的人胃腺癌細(xì)胞中HER2的表達(dá)，但miR-146促進(jìn)HER2表達(dá)的具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，幽門螺桿菌感染能促進(jìn)miR-146介導(dǎo)胃癌細(xì)胞中HER2的表達(dá)上調(diào)，這可能是幽門螺桿菌致使胃癌發(fā)病的機(jī)理之一，防治幽門螺桿菌感染對(duì)于胃癌的預(yù)防極為重要。