楊 強(qiáng)， 夏 紅， 賈 蓓， 董 劍， 賀小平， 時(shí)志鵬

重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院 感染科，重慶 402360

肝癌的病死率較高，嚴(yán)重威脅人類健康及生命[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，超過50%肝癌患者發(fā)生于中國[3]。肝炎病毒感染、酒精攝取過量及非酒精性脂肪肝等危險(xiǎn)因素是肝癌發(fā)生的重要因素[4]。同時(shí)，有研究證實(shí)，遺傳因素與肝癌的發(fā)生有不可忽視的關(guān)聯(lián)性[5]。內(nèi)皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)是新鑒定出的甘油三酯脂肪酶基因家族成員之一[6-7]。內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及肝細(xì)胞等多種細(xì)胞均可合成及分泌EL[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，EL除與代謝綜合征、炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化等有關(guān)外，還可通過為腫瘤細(xì)胞提供額外能量供應(yīng)以及參與細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)等方式參與腫瘤性疾病的發(fā)生和發(fā)展[9-11]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是由單個(gè)核苷酸改變導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性，是使機(jī)體對藥物反應(yīng)或疾病易感性差異的重要原因之一[12]。EL基因定位于染色體18q21.1上，其基因序列上存在多個(gè)SNP位點(diǎn)，影響其基因轉(zhuǎn)錄及翻譯，其突變可致EL功能缺陷，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展[8]。但是目前關(guān)于EL基因多態(tài)性與肝癌易感性相關(guān)性研究較少。筆者在美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)基因數(shù)據(jù)庫中篩選發(fā)現(xiàn)，rs2000812、rs2097055及rs2276269位點(diǎn)在中國人群中的突變率較高。因此，本研究旨在探討EL基因位點(diǎn)(rs2000812、rs2097055、rs2276269)的SNP與肝癌易感性的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015—2018年重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院收治的經(jīng)病理診斷為肝癌患者的全血標(biāo)本120例納入肝癌組，同期選取無腫瘤疾病、無家族遺傳病史的健康體檢者血液標(biāo)本120例納入健康組。肝癌組：男性83例，女性37例；年齡28.3～73.5歲，平均年齡(55.6±7.4)歲。健康組：男性77例，女性43例；年齡26.5～69.7歲，平均年齡(53.5±6.9)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 EL基因多態(tài)位點(diǎn)的篩選 打開NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，選擇gene選項(xiàng)，輸入“endothelial lipase”，獲得endothelial lipase基因信息。選擇“Homo sapiens”篩選出人類endothelial lipase基因信息。選擇SNP：GeneView選項(xiàng)獲得該基因SNP所有信息，根據(jù)錯(cuò)位突變、編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(coding-region single nucleotide polymorphism，cSNP)及最小等位基因頻(minor allele frequency，MAF)值篩選出rs2000812、rs2097055及rs2276269位點(diǎn)。

1.2.2 提取基因組的DNA 收集受試者清晨靜脈血2 ml，提取白細(xì)胞基因組DNA 時(shí)，采用DNA 提取試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司)，并在-70℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與PCR 從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中下載內(nèi)皮脂肪酶基因rs2000812、rs2097055及rs2276269 3個(gè)位點(diǎn)序列，使用MassARRAY Assay Design軟件(Sequenom公司)設(shè)計(jì)待測SNP位點(diǎn)的上下游引物并合成。rs2000812上游引物5′-CATGAGCTGAGATTGTTGTCAGTGC-3，下游引物3′-CAGTCAACCACAACTACATTGGCGTCTTTCTCTCAT-5′；rs2097055上游引物5′-TCAGGATTCTCGAGCAGTCC-3′，下游引物3′-CTTAGGGGAGGCCAAAAGGA-5′；rs2276269上游引物5′-GACACCCAGATCCTCCTCTC-3′，下游引物3′-AGGAGGACAAAGGGGATGAC-5′。引物均由上海生工合成，PCR總反應(yīng)體系為15 μl。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，94℃變性30 s，分別以63℃、60℃和59.5℃退火30 s，72℃延伸45 s。

1.2.4 基因分型檢測 應(yīng)用MassARRAY系統(tǒng)進(jìn)行SNP基因分型。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增跨越SNP位點(diǎn)的DNA序列，隨后擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，在SNP位點(diǎn)上延伸 1個(gè)堿基。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF)，分析延伸產(chǎn)物并輸出結(jié)果。本研究由上海吉瑪基因公司協(xié)助完成。采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型和等位基因頻率[13]。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者的臨床資料比較 兩組受試者在年齡、性別、糖尿病、高血壓、高脂血癥、吸煙等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但肝癌組患者飲酒及肝炎病毒感染史比例明顯高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組受試者的臨床資料比較/例(百分率/%)

2.2 兩組EL基因位點(diǎn)的SNP分布頻率 根據(jù)哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)遺傳平衡定律[14]，個(gè)體的等位基因分布頻率和基因型分布頻率在世代遺傳中維持恒定不變。本研究中，EL基因rs2000812位點(diǎn)、rs2097055位點(diǎn)及rs2276269位點(diǎn)的基因型頻率在兩組中的分布均符合 Hardy-Weinberg遺傳定律，具有群體代表性。且兩組受試者EL基因位點(diǎn)rs2000812、rs2097055及rs2276269 SNP位點(diǎn)分布頻率情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組受試者EL基因位點(diǎn)rs2000812、rs2097055及rs2276269 SNP位點(diǎn)分布頻率比較/例(百分率/%)

2.3 兩組EL基因位點(diǎn)SNP與肝癌易感性的相關(guān)性 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，EL rs2097055的TT、CT+CC基因型是影響肝癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。EL rs2000812和rs2276269的SNP與肝癌的發(fā)生無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 EL基因位點(diǎn)rs2000812、rs2097055及 rs2276269的SNP與肝癌危險(xiǎn)性關(guān)系/例(百分率/%)

2.4 EL rs2097055的TT、CT+CC基因型肝癌發(fā)生的影響因素 丙肝病毒感染是影響EL rs2097055 CT+CC基因型肝癌發(fā)生的影響因素。性別、年齡、高脂血癥等對不同基因型肝癌的發(fā)生無明顯影響。見表4。

表4 EL rs2097055的TT、CT+CC基因型肝癌發(fā)生的影響因素/例(百分率/%)

3 討論

基因突變在原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[15]。目前，部分致病基因逐步被發(fā)現(xiàn)，通過了解基因多態(tài)性對肝癌易感性所起的作用，有助于對肝癌進(jìn)行早期診斷，降低肝癌患者的病死率[15]。目前，EL基因多態(tài)性與肝癌發(fā)病的相關(guān)性研究較少。本研究結(jié)果顯示，EL rs2097055的TT、CT+CC基因型是影響肝癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。EL是由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及肝細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌合成。其主要作用是催化并水解高密度脂蛋白，快速將其從循環(huán)中清除，并生成大量游離的脂肪酸及載脂蛋白(apolipoprotein，APO)A1。有研究發(fā)現(xiàn)，EL參與代謝綜合征、炎癥、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[16-17]。Slebe等[11]研究發(fā)現(xiàn)，EL表達(dá)上調(diào)后能夠通過FoxA1和FoxA2介導(dǎo)的信號途徑刺激乳腺癌細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，EL通過DTX3L-ISG15脂肪酶非依賴途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力[12]。本研究篩選出EL基因的rs2000812、rs2097055及rs2276269位點(diǎn)，均富含C、T堿基序列，位于人18號染色體12p GRCh38的5′非編碼區(qū)域。有研究表明，rs2000812位點(diǎn)可能參與調(diào)節(jié)TC、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)及Apo A1等血脂代謝[18-20]。rs2097055位點(diǎn)可能參與調(diào)節(jié)低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、Apo B及甘油三酯等血脂代謝[21]。EL基因rs2276269與毛南族和漢族人APO A1水平有關(guān)[22]。由此可見，EL基因的rs2000812、rs2097055及rs2276269位點(diǎn)可能主要參與機(jī)體的脂質(zhì)代謝，其突變與血脂代謝失衡相關(guān)性疾病密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，EL rs2000812和rs2276269的SNP與肝癌的發(fā)生無相關(guān)性(P>0.05)。但EL rs2097055的TT、CT+CC基因型是影響肝癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血脂異常對不同基因型肝癌的發(fā)生無明顯影響，但丙肝病毒感染可影響EL基因rs2097055多態(tài)性和肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，使肝癌的易感性增加。這提示，EL基因rs2097055多態(tài)性可能參與丙肝感染后的免疫調(diào)節(jié)過程。

綜上所述，肝癌是由遺傳、環(huán)境等多種因素導(dǎo)致的惡性腫瘤疾病。EL基因rs2097055多態(tài)性與肝癌的發(fā)病具有相關(guān)性，其亦可能是肝癌的遺傳易感基因，攜帶此基因型患者罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)可能更高。