高金鵬， 李 濤

郴州市第一人民醫(yī)院1.神經(jīng)外科；2.重癥醫(yī)學(xué)科,湖南 郴州 423000

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是指由外傷因素引起的腦組織損傷，是神經(jīng)外科常見的急危重癥，也是導(dǎo)致創(chuàng)傷患者傷殘及病死的主要原因[1]。繼發(fā)性顱腦外傷的發(fā)病機制及治療是目前顱腦外傷臨床治療和研究的主要方向[2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent mating-type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)作為內(nèi)源性的神經(jīng)保護因子，在TBI中發(fā)揮神經(jīng)保護的作用[3]。線粒體自噬是細胞通過選擇性自噬清除功能異?；蚨嘤嗑€粒體的機制，細胞通過該機制維持線粒體質(zhì)量及功能的穩(wěn)定，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[4-5]。有研究表明，SIRT1通過促進PINK1-Parkin線粒體自噬發(fā)揮其生物學(xué)作用[6-7]，PINK1-Parkin途徑是線粒體自噬中研究較多的信號通路之一[8]。本研究旨在探討SIRT1是否通過PINK1-Parkin線粒體自噬抑制TBI中皮層神經(jīng)細胞凋亡，并改善TBI小鼠神經(jīng)功能障礙?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 小鼠B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、GAPDH、COX IV、PINK1、Parkin單克隆抗體購于中國武漢ABclonal公司，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL)試劑盒購于中國南京凱基生物公司，NeuN、抗神經(jīng)元表面粘附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM)單克隆抗體購于英國Abcam公司，SRT1720、Hoechst購于美國Sigma公司，線粒體分離試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 實驗動物模型與分組 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級C57BL/6小鼠，體質(zhì)量22～25 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心?；蚯贸?Parkin-/-)小鼠購于廣州賽業(yè)生物科技有限公司。建立TBI模型[9]，小鼠麻醉后于顱正中線左1 mm，人字縫上1 mm開一骨窗，采用控制性皮層損傷儀進行顱腦打擊(深度1.5 mm，速度4 m/s)。假模型小鼠僅鉆開骨窗，而不打擊致傷。第一階段實驗采用數(shù)字表法將小鼠隨機分為4組?？瞻捉M：野生型小鼠建立假模型后立即腹腔注射0.5 ml DMSO處理。對照組：野生型小鼠建立假模型后立即腹腔注射SIRT1激動劑SRT1720(20 mg/kg)處理[10]。模型組：野生型小鼠建立TBI模型后立即腹腔注射0.5 ml DMSO處理。治療組：野生型小鼠建立TBI模型后立即腹腔注射SRT1720(20 mg/kg)處理。小鼠在建立TBI模型3 d后處死，并檢查相關(guān)指標(biāo)。第二階段實驗采用數(shù)字表法將小鼠隨機分為5組?？瞻捉M：野生型小鼠建立假模型后立即腹腔注射0.5 ml DMSO處理。對照組：Parkin-/-小鼠建立假模型后立即腹腔注射0.5 ml DMSO處理。模型組：野生型小鼠建立TBI模型后立即腹腔注射0.5 ml DMSO處理。治療組：野生型小鼠建立TBI模型后立即腹腔注射SRT1720(20 mg/kg)處理。敲除組：Parkin-/-小鼠建立TBI模型后立即腹腔注射SRT1720(20 mg/kg)處理。小鼠在建立TBI模型3 d后處死，并檢查相關(guān)指標(biāo)。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白免疫印跡實驗 取損傷側(cè)的腦皮質(zhì)組織，勻漿離心取上清。取損傷側(cè)的腦皮質(zhì)組織，試劑盒分離線粒體蛋白及細胞質(zhì)蛋白。蛋白免疫印跡實驗檢測細胞PINK1、Bax、Bcl-2、線粒體Parkin及細胞質(zhì)Parkin蛋白表達。濃縮膠為5%，分離膠為12%，電泳后轉(zhuǎn)移到FVDF膜，一抗[PINK1(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Parkin(1∶1 000)、COX IV(1∶2 000)、GAPDH(1∶5 000)]4℃孵育過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，免疫化學(xué)發(fā)光法曝光并進行灰度值分析。

1.3.2 皮質(zhì)神經(jīng)元分離 參照文獻[11]，取損傷側(cè)大腦皮層并剪碎，碎片經(jīng)含2 mg/ml的木瓜酶DMEM培養(yǎng)液37℃孵育30 min后，血清終止消化。采用免疫粘附法純化神經(jīng)元。細胞懸液加入經(jīng)NCAM抗體包被過的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放置搖床1 h，收集粘附在培養(yǎng)皿底部的細胞即為神經(jīng)元。

1.3.3 凋亡細胞檢測 分離皮層神經(jīng)元，TUNEL法檢測細胞凋亡，方法參照試劑盒說明書。hoechst標(biāo)記細胞核，TUNEL標(biāo)記凋亡細胞。顯微鏡下觀察并計數(shù)每視野下凋亡細胞。

1.3.4 神經(jīng)功能評分 采用神經(jīng)功能缺損評分(modified neurological severity scores,mNSS)評估小鼠神經(jīng)功能。通過感覺、運動、生理反射和平衡能力測試小鼠神經(jīng)功能，總分為10分，分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重，完全正常為0 分。

1.3.5 腦水腫檢測 在取小鼠大腦并測其濕重。然后置于80℃烤箱烘烤48 h，稱干重。

腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%

2 結(jié)果

2.1 SIRT1對TBI中PINK1-Parkin線粒體自噬的影響 第一階段實驗，與空白組比較，模型組小鼠皮質(zhì)組織中PINK1及線粒體Parkin表達顯著增加，細胞質(zhì)Parkin表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，治療組小鼠皮質(zhì)組織中PINK1及線粒體Parkin表達顯著增加，細胞質(zhì)Parkin表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示SIRT1可以顯著上調(diào)TBI中PINK1-Parkin線粒體自噬水平。見圖1，表1。

圖1 SIRT1對PINK1-Parkin線粒體自噬的影響

表1 SIRT1對PINK1-Parkin線粒體自噬的影響

2.2 SIRT1通過線粒體自噬減輕TBI小鼠神經(jīng)細胞凋亡 第二階段實驗，與空白組比較，模型組小鼠神經(jīng)細胞凋亡率及Bax表達顯著增加，Bcl-2表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，治療組小鼠神經(jīng)細胞凋亡率及Bax表達顯著下降，Bcl-2表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與治療組比較，敲除組小鼠神經(jīng)細胞凋亡率及Bax表達顯著增加，Bcl-2表達顯著下降(P<0.05)。以上結(jié)果提示SIRT1可以顯著抑制TBI小鼠神經(jīng)細胞凋亡，而通過敲除Parkin基因阻斷線粒體自噬則抑制SIRT1在TBI小鼠中的神經(jīng)保護作用。見圖2、3，表2。

表2 SIRT1對神經(jīng)細胞凋亡的影響

圖2 SIRT1對細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.3 SIRT1通過線粒體自噬減輕TBI小鼠腦水腫及神經(jīng)功能障礙 與空白組比較，模型組小鼠腦水腫及mNSS評分顯著增加；與模型組比較，治療組小鼠腦水腫及mNSS評分顯著下降；與治療組比較，敲除組鼠腦水腫及mNSS評分顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示通過敲除Parkin基因抑制線粒體自噬可以導(dǎo)致TBI小鼠的腦水腫及神經(jīng)功能障礙加重。見表3。

表3 SIRT1對腦水腫及神經(jīng)功能的影響

3 討論

正常情況下，線粒體內(nèi)膜的內(nèi)膜蛋白剪切酶可以降解線粒體中的PINK1，因此,正常情況下細胞PINK1表達較低。在線粒體膜電位下降后，內(nèi)膜蛋白剪切酶活性被抑制，PINK1可以穩(wěn)定表達在線粒體外膜上，進而通過其磷酸化作用使細胞質(zhì)中的Parkin向線粒體移位。Parkin是一種E3泛素化酶，通過泛素化多種蛋白底物，從而與自噬蛋白發(fā)生結(jié)合及運動，最終使得線粒體被自噬體膜包裹并形成自噬體，進而被溶酶體吞食、降解[8]。因此，在本研究中，通過檢測PINK1表達及Parkin由細胞質(zhì)向線粒體的移位反映PINK1-Parkin線粒體自噬水平。本研究結(jié)果表明，在TBI小鼠中，PINK1-Parkin線粒體自噬被激活。

圖3 SIRT1對神經(jīng)細胞凋亡的影響(綠色熒光標(biāo)記的為凋亡細胞，藍色熒光標(biāo)記的為細胞核)

SIRT1通過PINK1-Parkin線粒體自噬發(fā)揮調(diào)節(jié)線粒體功能及氧化應(yīng)激的作用。有研究表明，SIRT1通過PINK1-Parkin線粒體自噬促進缺血再灌注腎小管上皮細胞修復(fù)[7]；SIRT1激動劑白藜蘆醇通過促進線粒體自噬減輕小鼠腦缺血/再灌注損傷[12]；SIRT1通過調(diào)節(jié)線粒體自噬減輕豬腸上皮細胞氧化應(yīng)激[6]。在本研究中，SIRT1可以促進TBI小鼠中PINK1-Parkin線粒體自噬水平，這與上述研究結(jié)果相符。有研究表明，SIRT1調(diào)節(jié)PINK1-Parkin線粒體自噬的機制可能與其去乙?；揎桭OXO3有關(guān)[7]。

顱腦外傷的損傷機制主要包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個方面，而繼發(fā)性損傷主要是指創(chuàng)傷后神經(jīng)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、壞死、凋亡等多因素加劇神經(jīng)損傷，介導(dǎo)神經(jīng)間接損傷[2]。研究表明，細胞凋亡是許多因素導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的發(fā)病機制之一[13]。抑制神經(jīng)細胞凋亡可以顯著改善失血性休克大鼠腦損傷[11]。在TBI中，發(fā)現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元凋亡，而抑制神經(jīng)元凋亡可以減輕TBI實驗動物神經(jīng)功能損傷評分及Morris水迷宮實驗延長等表現(xiàn)，提示神經(jīng)凋亡在TBI的發(fā)病、發(fā)展及后期神經(jīng)修復(fù)中均發(fā)揮重要作用[14]。激活SIRT1可以減輕TBI神經(jīng)細胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，SIRT1可以顯著減輕TBI神經(jīng)細胞凋亡及改善神經(jīng)功能障礙，但機制尚不清楚。有研究表明，線粒體自噬可以通過調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)及細胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用[4,8]，本研究通過敲除Parkin基因阻斷PINK1-Parkin線粒體自噬，發(fā)現(xiàn)阻斷線粒體自噬可以顯著抑制SIRT1在TBI中的神經(jīng)保護作用。

綜上所述，SIRT1通過上調(diào)PINK1-Parkin線粒體自噬，抑制TBI小鼠神經(jīng)細胞凋亡，從而改善神經(jīng)功能障礙。