雷建軍， 雷 佳， 周 南， 陳克研， 王 洋

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院1.實驗動物科；2.神經(jīng)外科；3.麻醉科，遼寧 沈陽 110016；4.中國醫(yī)科大學(xué) 實驗動物部，遼寧 沈陽 110013

體外循環(huán)為機(jī)械的侵入性循環(huán)輔助措施，其產(chǎn)生的腦血管栓塞、痙攣和腦組織的異常灌注可造成原發(fā)性腦損傷；各種核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子等激活所造成過度的炎性反應(yīng)又可造成繼發(fā)性腦損傷[1]。此外，體外循環(huán)還可誘導(dǎo)全身性炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙[2]。有研究報道，全身性炎癥反應(yīng)顯著影響體外循環(huán)相關(guān)病死率和發(fā)病率[3]。輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17，Th17)通過分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17，引起局部組織的炎癥性浸潤，誘導(dǎo)組織損傷。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)通過表達(dá)叉頭框蛋白p3(fork head box p3,Foxp3)發(fā)揮維護(hù)機(jī)體免疫平衡的作用。Th17/Treg在正常狀態(tài)下具有相互拮抗保持機(jī)體平衡的作用，二者比例與功能的失衡與腦梗死和各種炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。有研究報道，內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)可分泌大量包含多種生物學(xué)功能物質(zhì)的外泌體，能促進(jìn)腦創(chuàng)傷后的血管修復(fù)[5]。然而，Th17/Treg細(xì)胞免疫應(yīng)答在體外循環(huán)致腦損傷中的作用機(jī)制尚未明確。本研究通過建立無血預(yù)充非停跳體外循環(huán)術(shù)后認(rèn)知功能障礙模型，觀察來源于EPC的外泌體對體外循環(huán)大鼠腦組織炎癥性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響，并探討Th17/Treg細(xì)胞免疫應(yīng)答在其中的調(diào)控作用，為應(yīng)用EPC分泌的外泌體治療體外循環(huán)引發(fā)的腦損傷提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 纖維連接蛋白(LONZA，美國)；FITC-MEA-I(Sigma，美國)；DiI-Ac-LDL(Sigma，美國)；胎牛血清(SBI，美國)；ExoQick-TC外泌體試劑盒(SBI，美國)；FITC-CD4、PE-IL-17和BV421-Foxp3(BD，美國)；Fixation/Permeabilization Concentrate、Fixation Perm Diluent(eBioscience，美國)；TUNEL試劑盒(ROCHE，瑞士)；IL-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、血清酸性鈣結(jié)合蛋白(serum acidic calcium binding protein，S-100β)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)等酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒由深圳欣博盛生物科技有限公司提供；CD9、CD63和CD81(Abcame，美國)；B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific proteases 3，Caspase-3)等單克隆抗體由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；倒置熒光顯微鏡(FM-500，上海普丹光學(xué)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(Thermo，美國)，熒光顯微鏡(Olympus，日本)，流式細(xì)胞儀(BD，美國)。

1.2 動物分組與模型制備 選取無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雄性SD大鼠，周齡8～10周，由北京維通利華動物實驗技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22℃～25℃，12 h光亮/黑暗條件，自由飲食、飲水。采用隨機(jī)數(shù)字法將SD大鼠分為假手術(shù)組、體外循環(huán)組與外泌體處理組，每組15只。假手術(shù)組大鼠采用氣管插管機(jī)械通氣，僅在右股動脈、右頸內(nèi)靜脈穿刺置管；體外循環(huán)組建立無血預(yù)充非停跳體外循環(huán)術(shù)后認(rèn)知功能障礙模型，建模過程參照文獻(xiàn)[6]；外泌體處理組大鼠動物模型同體外循環(huán)組，待麻醉蘇醒且生命體征穩(wěn)定后，將其置于固定支架上，無菌狀態(tài)下尾靜脈注射200 μl外泌體懸浮液。

1.3 EPC外泌體培養(yǎng)與提取 EPC培養(yǎng)操作參考文獻(xiàn)[7]。采用美國SBI公司不含外泌體的血清配制EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)EPC，培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)基，3 000 r/min離心10 min；吸取培養(yǎng)基上清，加入適量的ExoQuick-TC試劑，充分混勻；4℃過夜，1 500 r/min離心30 min；棄掉上清液，1 500 r/min離心5 min，棄掉上清液；試管底部白色沉淀即為外泌體。采用免疫蛋白印跡法對提取物進(jìn)行特征性外泌體標(biāo)記蛋白CD9、CD63和CD81檢測。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)功能學(xué)評分 制模后第3、5天采用Garcia神經(jīng)功能評價標(biāo)準(zhǔn)評估大鼠神經(jīng)功能狀況[8]。

1.4.2 TUNEL染色法檢測神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡水平 制模后第5天處死大鼠，生理鹽水灌流，分離腦組織，常規(guī)固定、包埋、切片、脫蠟至水后磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次，每次5 min；加入適量破膜工作液，室溫孵育25 min，PBS清洗3次，每次5 min；按照2∶29比例加入平衡工作液和TdT的混合液，37℃孵育2.5 h；PBS清洗3次，每次5 min；滴加適量DAPI染液，室溫避光孵育15 min；PBS清洗3次，每次5 min；封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并收集圖像。設(shè)置陰性對照。神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)綠色凋亡即為凋亡陽性細(xì)胞。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測炎癥因子及腦損傷標(biāo)記物表達(dá)水平 制模后第5天處死大鼠，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、S-100β、NSE水平。大鼠麻醉，眼球取血，靜置后離心獲取上清，置于EP管中于-80℃保存待用。向每孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或血清100 μl，充分混勻，37℃孵育120 min，洗板5次；每孔中加入一抗工作液100 μl；充分混勻，37℃孵育120 min，洗板5次；每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μl，充分混勻，37℃孵育120 min，洗板5次；每孔加入底物100 μl，37℃ 避光孵育15 min；加入100 μl終止液混勻；提前30 min預(yù)熱酶標(biāo)儀，在450 nm處測吸光值。

1.4.4 免疫蛋白印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平 制模后第5天處死大鼠，分離腦組織，免疫蛋白印跡法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)水平。取適量海馬組織，充分裂解后，12 000 r/min、4℃離心15 min，收集上清。蛋白質(zhì)定量法對各組上清樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析，取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；按照1∶1 000比例配置Bcl-2、Bax、Caspase-3以及GAPDH抗體稀釋液，4℃過夜孵育，TBST洗膜3次，每次5 min。按照1∶5 000比例配置HRP標(biāo)記的二抗稀釋液，室溫孵育1 h。采用ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像，應(yīng)用Image J軟件計算條帶灰度值，將目的條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值作為結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17/Treg細(xì)胞亞群水平 制模后第5天麻醉大鼠，于無菌超凈臺內(nèi)分離脾并研磨，預(yù)冷PBS清洗2次；加入紅細(xì)胞裂解液，4℃孵育5 min，預(yù)冷PBS清洗1次，計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，設(shè)置CD4、IL-17和FOXP3的單標(biāo)管和陰性對照管；100 μl取106個細(xì)胞，加入配置好的離子霉素、Brfeldin A和PMA混合液，CO2溫箱中刺激 5 h；預(yù)冷PBS清洗2次，加入FITC-CD4抗體稀釋液，4℃孵育30 min；預(yù)冷PBS清洗1次，加入固定透膜液，4℃孵育50 min；洗液清洗細(xì)胞1次，向內(nèi)加入PE-IL-17和BV421-FOXP3抗體稀釋液，4℃孵育30 min；上機(jī)檢測。

2 結(jié)果

2.1 大鼠Garcia 神經(jīng)功能評分比較 與假手術(shù)組比較，體外循環(huán)組、外泌體處理組各個時間點大鼠的Garcia 神經(jīng)功能評分均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與體外循環(huán)組比較，外泌體處理組各個時間點大鼠的Garcia 神經(jīng)功能評分明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠Garcia 神經(jīng)功能評分評分/分)

2.2 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況 與假手術(shù)組比較，體外循環(huán)組、外泌體處理組腦細(xì)胞凋亡明顯；與體外循環(huán)組比較，外泌體處理組凋亡陽性細(xì)胞明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色×200)

2.3 炎癥因子及腦損傷標(biāo)記物表達(dá)水平比較 體外循環(huán)組、外泌體處理組中IL-1β、TNF-α、IL-6、S-100β及NSE水平均明顯高于假手術(shù)組，IL-10水平明顯低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。外泌體處理組IL-1β、TNF-α、IL-6、S-100β及NSE水平均明顯低于體外循環(huán)組，IL-10水平明顯高于體外循環(huán)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 炎癥因子及腦損傷標(biāo)記物表達(dá)水平

2.4 Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)水平比較 與假手術(shù)比較，體外循環(huán)組、外泌體處理組Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax、Caspase-3表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與體外循環(huán)組比較，外泌體處理組Bcl-2表達(dá)水平升高，Bax、Caspase-3表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)水平

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17/Treg細(xì)胞亞群水平結(jié)果分析 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腦組織中的Th17(CD4+IL-17+T)、Treg(CD4+FOXP3+T)細(xì)胞含量，結(jié)果見圖3。與假手術(shù)組比較，體外循環(huán)組、外泌體處理組中的CD4+IL-17+T細(xì)胞百分比明顯升高，CD4+FOXP3+T細(xì)胞百分比明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與體外循環(huán)組比較，外泌體處理組中的CD4+IL-17+T細(xì)胞百分比明顯降低，CD4+FOXP3+T細(xì)胞百分比明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17/Treg細(xì)胞亞群水平

3 討論

體外循環(huán)術(shù)是借助特殊的血液處理裝置來完成血液循環(huán)和氧氣運輸?shù)囊环N技術(shù)，但其會誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種并發(fā)癥，其中，腦損傷會使患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。目前，應(yīng)用藥物降低體外循環(huán)腦損傷已成為研究的重點。本研究中，外泌體處理組各個時間點大鼠的Garcia 神經(jīng)功能評分高于體外循環(huán)組，凋亡陽性的細(xì)胞數(shù)量明顯少于體外循環(huán)組，提示EPC分泌的外泌體能夠緩解腦損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

體外循環(huán)期間血液與裝置異物的接觸、內(nèi)毒血癥、栓塞引起的缺血和再灌注損傷等均可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而激活單核細(xì)胞釋放炎癥因子，引起全身性炎癥反應(yīng)綜合征[9-10]。此外，體外循環(huán)引起腦損傷后，血腦屏障通透性增加，存在于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)中的S-100β、NSE可通過血腦屏障進(jìn)入血液。有研究報道，血漿S-100β、NSE的濃度變化與體外循環(huán)后認(rèn)知障礙具有相關(guān)性，二者同時上升有助于確診體外循環(huán)后認(rèn)知障礙[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，體外循環(huán)組、外泌體處理組中IL-1β、TNF-α、IL-6、S-100β及NSE水平均明顯升高，IL-10水平明顯降低。而外泌體處理組IL-1β、TNF-α、IL-6、S-100β及NSE水平均明顯低于體外循環(huán)組，IL-10水平明顯高于體外循環(huán)組，說明EPC來源的外泌體能夠降低血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、S-100β、NSE的含量，促進(jìn)IL-10的表達(dá)，提示EPC來源的外泌體能夠抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死是體外循環(huán)后腦損傷發(fā)生的主要原因。Bcl-2基因家族及相關(guān)蛋白質(zhì)在神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[12]。尤其是Caspase-3/Bax/Bcl-2信號通路。Caspase-3活化的作用是進(jìn)一步促進(jìn)凋亡的發(fā)生、發(fā)展，而Bax則為促凋亡的蛋白，Bcl-2是抑制凋亡的蛋白。當(dāng)細(xì)胞凋亡時，Bax表達(dá)量會增多，促進(jìn)線粒體通透性增加，激活Caspase-3蛋白酶，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，外泌體干預(yù)后顯著下調(diào)體外循環(huán)腦損傷大鼠腦組織中Bax、Caspase-3表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，說明EPC來源的外泌體促能夠緩解體外循環(huán)后腦損傷，其作用機(jī)制可能通過調(diào)控Bcl-2/Bax通路抑制腦細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)。

細(xì)胞免疫應(yīng)答在體外循環(huán)引發(fā)的腦損傷中發(fā)揮重要作用。Th17除能分泌IL-17、IL-21和IL-23外，還能分泌IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子，而IL-17又能進(jìn)一步促進(jìn)IL-1、IL-6和 TNF-α等炎癥因子、趨化因子、補(bǔ)體的基因轉(zhuǎn)錄；促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在炎癥局部的聚集活化，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13]。在IL-21和IL-23的作用下，Treg可轉(zhuǎn)變?yōu)檠装Y性T細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)[14]。Th17細(xì)胞分泌的IL-17能夠促進(jìn)核因子κB的活化，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生抑癌基因、死亡因子配體等促凋亡因子，經(jīng)過級聯(lián)反應(yīng)，激活蛋白酶Caspase導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[15]。研究表明，阻斷IL-17能夠調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2介導(dǎo)的線粒體細(xì)胞凋亡通路，抑制肺內(nèi)細(xì)胞凋亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，外泌體處理組Th17(CD4+IL-17+T)細(xì)胞百分比明顯低于體外循環(huán)組，Treg(CD4+FOXP3+T)細(xì)胞百分比明顯高于體外循環(huán)組，提示EPC來源的外泌體發(fā)揮保護(hù)作用與調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡有關(guān)。

綜上所述，EPC來源的外泌體能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞的動態(tài)平衡，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的分泌和Caspase-3/Bax/Bcl-2信號通路的活化，進(jìn)而改善體外循環(huán)后腦損傷。本研究為防治體外循環(huán)腦損傷提供了新的研究思路，但具體相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。