尹香琳，王馨悅，韓安娜，李楠，楊洋

（1.延邊大學醫(yī)學院，吉林 延吉133002；2. 溫州大學，浙江 溫州325035）

子宮內膜癌（Endometrial carcinoma, EC）是最常見的女性生殖系統(tǒng)侵襲性腫瘤之一[1]，50～59 歲為其發(fā)病高峰期。在美國，EC 的新發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第4 位，占每年新發(fā)癌癥的7%，死亡患者高達10 170 例[2]。在中國，EC 新發(fā)病率不斷上升，僅次于宮頸癌[3]，每年新發(fā)患者約為5 萬例，死亡人數(shù)為1.8 萬[4]，且患者呈現(xiàn)明顯的年輕化趨勢。由于部分早期EC 患者對傳統(tǒng)手術治療方法較為抵觸，且中晚期EC 患者生存期短，治療效果差，預后欠佳，因此發(fā)現(xiàn)新型生物標志物對EC 早期診斷、靶向治療及預后評估有著重要的臨床意義。

壽命蛋白（Mortalin/HSPA9/GRP75/mtHSP70/HSPA9B）是一種葡萄糖調節(jié)蛋白，約75 kD，屬于熱休克蛋白70 家族，是高度保守的線粒體分子伴侶蛋白[5]。其在核編碼蛋白的轉運、蛋白完整性的保持、細胞周期調控和線粒體產能等方面有至關重要的作用[6]。研究表明，Mortalin 蛋白在正常組織中無表達或低表達，但在多種惡性腫瘤中異常高表達，如肝癌、胰腺癌、甲狀腺癌、結腸癌、卵巢癌等[6-9]。但關于Mortalin 蛋白在EC 組織中的表達尚未見報道。本研究應用免疫組織化學EnVision法檢測Mortalin 蛋白在88 例EC 組織和37 例正常子宮內膜組織中的表達，探討其與EC 臨床病理特征的關系，并分析Mortalin 蛋白表達在EC 患者臨床預后評估中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

收集2011年5月—2014年12月上海芯超科技有限公司組織芯片和吉林大學第二醫(yī)院的EC 組織標本，包括88例EC組織和37例正常子宮內膜組織。88 例EC 標本中，年齡＜50 歲20 例，≥50 歲68 例；有淋巴結轉移25 例，無淋巴結轉移63 例；病理分級：I 級25 例，Ⅱ級48 例，Ⅲ級15 例；國際TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ期60 例，Ⅲ+Ⅳ期28 例。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，蘇木精染液購自珠海貝索生物技術有限公司，Mortalin抗體（ab53098）購自美國Abcam公司。

1.2 免疫組織化學染色

采用免疫組織化學EnVision 法檢測Mortalin 蛋白的表達[10]：4 μm 厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，抗原修復，滴加一抗Mortalin 抗體（稀釋比1∶200），4℃孵育過夜；次日滴加二抗，DAB 顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封固。為證明Mortalin 蛋白抗體免疫組織化學檢測的特異性，選用Mortalin 蛋白強陽性染色的切片，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗的染色結果作為陰性對照。根據(jù)Beesly 分級法，以細胞質中出現(xiàn)棕褐色顆粒為Mortalin 蛋白陽性染色的標準。根據(jù)細胞染色強度進行判斷，細胞質中無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。根據(jù)陽性細胞數(shù)的比例判斷：陽性細胞數(shù)0%～5%為0 分，＞5%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分。將兩項得分結果相乘：0 分為（-），1～4 分 為（+），5～8分為（++），9～12 分為（+++）。以總分≤4分為低表達，總分＞4分為高表達。

1.3 生存分析

應用UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）分析Mortalin mRNA 在EC組織中的表達水平，采用The Human Protein Atlas （https：//www.proteinatlas.org/） 和The Cancer Genome Atlas（TCGA）（http：//kmplot. com/analysis/index. php? p=service＆start=1）數(shù)據(jù)庫分析Mortalin 蛋白表達與EC患者預后的關系，并根據(jù)基因和蛋白的相對表達量將樣本分為高表達組和低表達組，統(tǒng)計和分析EC 患者的預后情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%） 表示，比較采用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較采用Log-rank χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Mortalin蛋白在EC組織中高表達

免疫組織化學檢測結果顯示，Mortalin 蛋白在正常子宮內膜組織中低表達或不表達，在EC 組織中高表達，且主要表達于細胞質（見圖1）。Mortalin 蛋白在EC 組織中的陽性率和強陽性率分別與正常子宮內膜組織中的陽性率和強陽性率比較，采用χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=40.815和31.582，均P=0.000），EC組織均高于正常子宮內膜組織（見表1）。

圖1 Mortalin 蛋白在正常子宮內膜和各組子宮內膜癌組織中的表達 （EnVision 法×400）

表1 正常子宮內膜組織和EC組織中的Mortalin蛋白表達陽性率和強陽性率的比較

2.2 EC患者不同因素間Mortalin蛋白強陽性率的比較

Mortalin蛋白高表達與病理分級、TNM分期及是否有淋巴結轉移有相關性（P＜0.05），但與年齡無關（P＞0.05）（見表2）。其中，病理分級Ⅲ級的Mortalin蛋白陽性率與Ⅰ級和Ⅱ級比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Ⅲ級Mortalin 蛋白的陽性率高于Ⅰ級和Ⅱ級；TNM分期晚期（Ⅲ、Ⅳ期）的Mortalin蛋白高表達率與早期（Ⅰ、Ⅱ期）的高表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），晚期（Ⅲ、Ⅳ期）高于早期（Ⅰ、Ⅱ期）；有淋巴結轉移的Mortalin 蛋白高表達率與無淋巴結轉移的高表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移。根據(jù)該結果，本研究通過運用JMP10 軟件，直觀地展現(xiàn)了Mortalin 蛋白在不同的病理分級、TNM 分期及有無淋巴結轉移的情況下的蛋白表達差異性（見圖2）。

2.3 正常子宮內膜組織和EC 組織中的Mortalin mRNA 表達比較

UALCAN 數(shù)據(jù)庫顯示，與正常子宮內膜組織Mortalin mRNA相對表達量（109.02±39.25）比較，EC組織Mortalin mRNA相對表達量（136.42±120.9）較高（t=39.827，P=0.000）（見圖3）。提示Mortalin mRNA在EC 早期診斷、靶向治療和預后分析中具有重要的作用。

表2 不同因素Mortalin蛋白強陽性率的比較

圖2 不同病理分級、TNM分期、淋巴結轉移情況下Mortalin蛋白表達差異性

圖3 Mortalin mRNA在正常子宮內膜組織和EC組織中的表達比較 （UALCAN數(shù)據(jù)庫）

2.4 Mortalin蛋白高表達預示預后不良

The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計分析結果表明，Mortalin 蛋白高表達EC 患者的生存期短于Mortalin 蛋白低表達EC 患者（χ2= 4.515，P= 0.037）（見圖4）；TCGA 數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計分析結果顯示，Mortalin mRNA高表達的EC患者其預后比Mortalin mRNA低表達EC 患者差（χ2= 4.475，P= 0.034）（見圖5）。該結果提示Mortalin 有望成為EC 患者預后評估的重要新型分子標志物之一。

圖4 Mortalin蛋白與EC患者生存期的關系（The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫）

圖5 Mortalin mRNA與EC患者生存期的關系（TCGA數(shù)據(jù)庫）

3 討論

Mortalin 蛋白首次在正常小鼠成纖維細胞質中克隆而來，定位于染色體5q31.2，是一種主要位于線粒體的非熱應激誘導蛋白質，可以與細胞內多種蛋白質相互作用，具備線粒體產能、分子伴侶、使腫瘤低分化等多種功能[11]，該蛋白在除線粒體以外的其他細胞器中也同樣起著諸多作用，如信號轉導、應激反應、細胞增殖等生物學功能[12]。有文獻研究結果顯示[5]，正常情況下Mortalin 蛋白在細胞中心體通過結合P53、MPS1等多種基因或激酶來維持原有的造血功能，敲除Mortalin 蛋白使P53、MPS1等不能保持正常細胞狀態(tài)和染色體穩(wěn)定性，導致骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome, MDS）等疾病的發(fā)生，因此，Mortalin 蛋白是人體不可或缺的基因蛋白。同時，Mortalin 蛋白亦可在多種惡性腫瘤中異常表達。研究表明[8]，Mortalin 蛋白在卵巢癌組織中表達顯著上調，且與臨床分期、分化程度及生存期相關。CUI 等[6]的研究表明Mortalin 蛋白在胰腺癌組織中與臨床分期、淋巴結轉移、生存期等相關，且Mortalin 蛋白的表達明顯高于其癌旁組織，可作為胰腺癌的獨立預后因素；另外，推測其主要機制是過表達的Mortalin 蛋白抑制P53 的轉錄活性，而這一機制亦被YI 等[7]學者推斷為Mortalin 蛋白過表達促進肝癌發(fā)生和進展的基礎。截至目前，尚無有關Mortalin蛋白與子宮內膜癌之間關系的報道。

本研究發(fā)現(xiàn)Mortalin 蛋白表達定位于EC 細胞質，且在EC 組織中的表達水平高于正常子宮內膜組織。進一步分析Mortalin 蛋白過表達與EC 臨床病理特征的關系發(fā)現(xiàn)，Mortalin 蛋白在病理分級Ⅲ級EC 組織中的高表達率高于Ⅰ級和Ⅱ級EC 組織；TNM 晚期EC 組織中的高表達率高于早期EC 組織；有淋巴結轉移的EC 組織中的高表達率高于無淋巴結轉移的EC 組織。本研究結果表明，隨著EC 疾病的進展，Mortalin 蛋白的表達呈升高趨勢。這一結果與JIN 等[13]在乳腺癌中Mortalin 蛋白表達的結果相符。

本研究運用The Human Protein Atlas 和TCGA 數(shù)據(jù)庫來分析Mortalin 蛋白和mRNA 的表達與EC 患者預后的關系，發(fā)現(xiàn)Mortalin 蛋白和mRNA 高表達患者的生存期低于低表達患者，提示Mortalin 過表達有望成為EC 患者不良預后的重要新型分子標志物。

綜上所述，Mortalin 蛋白在EC 組織中高表達，且隨著病理分級和臨床分期的升高及淋巴結轉移呈升高趨勢，說明Mortalin 蛋白在EC 的惡性演進過程中起重要作用，提示Mortalin 蛋白可以成為EC 預后評估的分子標志物，但其是否可以成為EC 靶向治療的新靶點，則有待進一步的深入研究。