張亞男，張子旸，劉海英，王書惠

（牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江157011）

宮頸癌是最常見的危害婦女健康及生命的主要惡性腫瘤之一，因極高的病死率而備受國內(nèi)外研究者的關(guān)注。據(jù)國際癌癥研究中心統(tǒng)計(jì)，2013年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例約48.5 萬，死亡病例約23.6 萬，其中發(fā)展中國家約占85%[1]。有研究數(shù)據(jù)表明，我國宮頸癌發(fā)病率為12.96/10 萬，病死率為3.28/10 萬，且發(fā)病率和病死率均隨年齡的增長而增加[2]。宮頸癌的主要病因可能與人乳頭瘤病毒感染有關(guān)，其他如機(jī)體免疫功能低下、吸煙與被動吸煙、口服避孕藥、人工流產(chǎn)次數(shù)過多、性伴侶過多、丈夫包皮過長、早婚、結(jié)婚次數(shù)過多、多產(chǎn)及初產(chǎn)年齡過早均可成為誘發(fā)宮頸癌危險(xiǎn)因素[3-5]。近年來，中藥以其有效低毒的優(yōu)勢作為治療腫瘤的替代療法日益得到人們的重視。冬凌草甲素是冬凌草的主要有效成分，為二萜類化合物。除冬凌草外，同屬植物藍(lán)萼香茶菜、毛葉香茶菜等亦可分離出冬凌草甲素?，F(xiàn)代藥理研究表明，冬凌草甲素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[6]，可以治療胰腺癌[7]、卵巢癌[8]、食管癌[9]、肝癌[10]、肺癌[11]、乳腺癌[12]、前列腺癌[13]、直腸癌等[14]。研究表明，冬凌草甲素亦可誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡[15]。但是冬凌草甲素誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究較少。本研究采用體外培養(yǎng)HeLa 細(xì)胞，探討線粒體凋亡途徑在冬凌草甲素誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

冬凌草甲素（中國科學(xué)院昆明植物研究所），二甲基亞砜（DMSO，終濃度≤0.01%）（上海浩然生物技術(shù)有限公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所），CCK-8 試劑盒（美國Abbkine公司），TUNEL 檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI 試劑盒（南京凱基生物有限公司），碘化丙錠（PI）（美國Axygen 公司），JC-1 檢測試劑盒（上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司），兔抗人細(xì)胞色素c（Cyt c）抗體、兔抗人B 細(xì)胞淋巴瘤-2 因子（Bcl-2）抗體和兔抗人Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體（美國Cell Signal 公司），半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）活性測定試劑盒（北京紐樸生物技術(shù)有限公司）。Model 311 型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司），F(xiàn)C-500 流式細(xì)胞儀（美國Beckman 公司），BX43 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），Bio-Tek ELX800 型多功能酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD 公司），Tanon 5200 Multi 圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌HeLa 細(xì)胞（美國ATCC）接種于含10%熱滅活FBS、2%谷氨酰胺、100 u/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48 h 更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8 檢測HeLa 細(xì)胞活力檢測方法參照CCK-8 試劑盒操作說明書進(jìn)行。將處于對數(shù)生長期的HeLa 細(xì)胞按4×106個(gè)/ml 接種于96 孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后向各培養(yǎng)孔中加不同濃度的冬凌草甲素100 μl，濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L?？瞻讓φ湛准尤氲润w積不含冬凌草甲素的RPMI 1640 培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h后終止培養(yǎng)。向各培養(yǎng)孔中加入10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。于酶標(biāo)儀450 nm 波長處測定光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞活力，并應(yīng)用Bliss 法計(jì)算IC50值。

1.3.2 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測HeLa 細(xì)胞凋亡參照Annexin V-FITC/PI 試劑盒操作說明書進(jìn)行操作。待HeLa 細(xì)胞貼壁后向各培養(yǎng)孔中加入5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L 冬凌草甲素，空白對照孔加入等體積不含冬凌草甲素的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。胰蛋白酶消化，1 200 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，250 μl 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，各培養(yǎng)孔依次加入Annexin V-FITC 和PI 液各5 μl 混勻，室溫避光反應(yīng)15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡率。

1.3.3 TUNEL 染色檢測HeLa 細(xì)胞凋亡參照TUNEL 試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測。分組及給藥同1.3.2。棄培養(yǎng)基，PBS 洗滌2 次，4%多聚甲醛固定后，PBS 洗滌3 次，各培養(yǎng)孔加入50 μl TUNEL反應(yīng)液，避光37℃培養(yǎng)1 h，PBS 洗滌3次，Hoechst 33258 染料37℃避光染色10 min，中性樹膠封片，BX43 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)，計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.3.4 JC-1 染色檢測HeLa 細(xì)胞Δψm參照J(rèn)C-1試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測。吸取500 μl RPMI 1640 培養(yǎng)液，加入1 μl JC-1，渦旋混勻，37℃孵育，配成JC-1 工作液。分組及給藥同1.3.2。棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌2 次，各培養(yǎng)孔加入1 ml JC-1，培養(yǎng)20 min。棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌2 次，各培養(yǎng)孔加入RPMI 1640 培養(yǎng)液。采用熒光顯微鏡觀察綠色和紅色熒光。如Δψm 較低，JC-1 為單體，不能聚集在線粒體基質(zhì)中，則發(fā)出綠色熒光；如Δψm 較高，JC-1 以聚合物形式聚集在線粒體基質(zhì)中，則發(fā)出紅色熒光。計(jì)算綠色/紅色熒光，以綠色/紅色熒光代表Δψm；綠色/紅色熒光升高表示Δψm 下降；綠色/紅色熒光降低表示Δψm 升高。

1.3.5 Western blotting 檢測HeLa 細(xì)胞Cyt c、Bcl-2和Bax的表達(dá)分組及給藥同1.3.2。1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，充分裂解后提取總蛋白，用BCA法測定蛋白相對表達(dá)量。以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺預(yù)制凝膠，各培養(yǎng)孔加入50 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳。常規(guī)轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉2 h。分別與Ⅰ抗兔抗人Cyt c 多克隆抗體（1∶500）、兔抗人Bcl-2 多克隆抗體（1∶500）和兔抗人Bax 多克隆抗體（1∶500）4℃孵育過夜，PBST 洗脫10 min/次，共3 次，洗膜后加辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗孵育2 h，TBST 洗脫，5 min/次，共3 次，加入電化學(xué)發(fā)光試劑顯影，Tanon 5200 Multi圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3.6 Caspase-3 和Caspase-9 活性檢測參照Caspase-3 和Caspase-9 活性測定試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測。分組及給藥同1.3.2，細(xì)胞裂解同1.3.5。吸取50 μl 細(xì)胞裂解上清液，加入50 μl 2×反應(yīng)緩沖液，分別加入5 μl Caspase-3 和Caspase-9 底物，37℃避光孵育4 h。于酶標(biāo)儀405 nm 波長處測定OD值，計(jì)算Caspase-3 和Caspase-9 活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LDS-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對HeLa細(xì)胞活力的影響

各實(shí)驗(yàn)組與空白對照組12 h、24 h、36 h、48 h的HeLa 細(xì)胞活力比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)HeLa細(xì)胞活力有差異（F=31.457，P=0.000）；②各組HeLa 細(xì)胞活力有差異（F=273.936，P=0.000），隨著冬凌草甲素濃度增加，HeLa細(xì)胞活力降低；③各組HeLa細(xì)胞活力變化趨勢有差異（F=27.837，P=0.000）（見表1）。冬凌草甲素處理12 h、24 h、36 h、48 h 的IC50為95.63 μmol/L、32.24 μmol/L、19.58 μmol/L和4.13 μmol/L。因24 h IC50＞25 μmol/L，故以≤25 μmol/L（即5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）為冬凌草甲素處理濃度，處理24 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)HeLa細(xì)胞活力的比較 （n=6，%，±s）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)HeLa細(xì)胞活力的比較 （n=6，%，±s）

注：?與空白對照組比較，P ＜0.05。

組別48 h 12 h 24 h 36 h空白對照組5 μmol/L冬凌草甲素組10 μmol/L冬凌草甲素組25 μmol/L冬凌草甲素組50 μmol/L冬凌草甲素組100 μmol/L冬凌草甲素組100.00±0.00 49.08±9.86?37.12±6.36?29.63±4.91?28.05±4.76?24.22±3.22?100.00±0.00 95.67±21.89 79.26±16.50 65.54±13.85?58.21±12.55?50.87±11.12?100.00±0.00 75.46±15.17?59.37±12.90?52.20±10.84?38.72±6.98?27.10±4.21?100.00±0.00 61.01±13.37?52.01±10.70?46.37±9.18?29.34±4.86?26.27±3.72?

2.2 冬凌草甲素對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

2.2.1 各組HeLa 細(xì)胞凋亡率比較各組HeLa 細(xì)胞凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.018，P=0.002）；與空白對照組比較，5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L 冬凌草甲素組HeLa 細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖1和表2。

圖1 冬凌草甲素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖

2.2.2 TUNEL染色結(jié)果各組HeLa細(xì)胞凋亡指數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.061，P=0.000）；與空白對照組比較，5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L冬凌草甲素組HeLa細(xì)胞凋亡指數(shù)升高（P＜0.05）。見表2和圖2。

2.3 冬凌草甲素對HeLa細(xì)胞Δψm的影響

各組HeLa細(xì)胞綠色/紅色熒光比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與空白對照組比較，5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L 冬凌草甲素組HeLa 細(xì)胞綠色/紅色熒光升高（P＜0.05）。提示冬凌草甲素可降低HeLa細(xì)胞Δψm。見表3和圖3。

表2 各組HeLa細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù)比較（n=6，±s）

表2 各組HeLa細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù)比較（n=6，±s）

注：?與空白對照組比較，P ＜0.05。

組別凋亡指數(shù)凋亡率/%空白對照組5 μmol/L冬凌草甲素組10 μmol/L冬凌草甲素組25 μmol/L冬凌草甲素組F 值P 值2.98±0.31 8.57±0.88?29.51±3.26?32.91±3.63?16.061 0.000 6.50±0.69 11.49±1.25?13.41±1.47?19.53±2.02?14.018 0.002

圖2 冬凌草甲素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡 （TUNEL染色×200）

表3 各組HeLa細(xì)胞Δψm的比較（n=6，±s）

表3 各組HeLa細(xì)胞Δψm的比較（n=6，±s）

注：?與空白對照組比較，P ＜0.05。

組別綠色/紅色熒光空白對照組5 μmol/L冬凌草甲素組10 μmol/L冬凌草甲素組25 μmol/L冬凌草甲素組F 值P 值1.00±0.00 1.91±0.19?2.07±0.23?3.89±0.41?4.577 0.047

2.4 冬凌草甲素對HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Cyt c、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

各組HeLa 細(xì)胞Cyt c、Bcl-2、Bax 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與空白對照組比較，5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L 冬凌草甲素組HeLa 細(xì)胞Cyt c、Bax 表達(dá)升高（P＜0.05），Bcl-2、Bcl-2/Bax 降低（P＜0.05）。見表4和圖4。

圖3 冬凌草甲素對HeLa細(xì)胞Δψm的影響 （JC-1染色×400）

表4 各組HeLa細(xì)胞Cyt c、Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax相對表達(dá)量比較 （n=6，±s）

表4 各組HeLa細(xì)胞Cyt c、Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax相對表達(dá)量比較 （n=6，±s）

注：?與空白對照組比較，P ＜0.05。

組別Bcl-2/Bax Cyt c Bcl-2 Bax空白對照組5 μmol/L冬凌草甲素組10 μmol/L冬凌草甲素組25 μmol/L冬凌草甲素組F 值P 值1.000±0.000 0.343±0.041?0.281±0.030?0.142±0.021?9.076 0.015 1.000±0.000 1.942±0.301?6.792±0.805?11.818±2.193?23.628 0.001 1.000±0.000 0.617±0.082?0.536±0.074?0.443±0.061?4.041 0.039 1.000±0.000 1.723±0.231?1.865±0.292?3.076±0.453?6.367 0.032

圖4 冬凌草甲素對HeLa細(xì)胞Cyt c、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

2.5 冬凌草甲素對HeLa 細(xì)胞Caspase-3、Cas‐pase-9活性的影響

各組HeLa 細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9 活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與空白對照組比較，5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L 冬凌草甲素組Caspase-3、 Caspase-9 活性升高（P＜0.05）。見表5。

表5 各組HeLa細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性比較（n=6，%，±s）

表5 各組HeLa細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性比較（n=6，%，±s）

注：?與空白對照組比較，P ＜0.05。

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3 討論

細(xì)胞凋亡在維持體內(nèi)細(xì)胞或組織平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，凋亡缺陷是腫瘤發(fā)病的重要病因?qū)W基礎(chǔ)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素具有明顯的誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡的作用。另外，本研究結(jié)果亦顯示，冬凌草甲素呈劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)抑制HeLa 細(xì)胞活力。以上結(jié)果與以往研究結(jié)果相類似[15，18]。

腫瘤細(xì)胞的生長速度一般難以控制，這可能與細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng)和凋亡能力的減弱有關(guān)。細(xì)胞凋亡途徑根據(jù)啟動過程包括線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑，特別是線粒體凋亡途徑在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中承擔(dān)重要角色[19]。線粒體是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞器，在凋亡過程中具有重要的調(diào)控作用，而線粒體損傷造成Δψm 下降是細(xì)胞啟動凋亡的一個(gè)特征性標(biāo)志，為細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一[20-21]。本研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素可顯著降低HeLa 細(xì)胞Δψm。以上結(jié)果初步提示，凌草甲素誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)。

Cyt c是位于線粒體中的一種水溶性小分子物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)能量代謝和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的功能，為線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵調(diào)控蛋白之一[22]。Caspase 蛋白家族是細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用的一組半胱氨酸蛋白酶，一旦被凋亡觸發(fā)因素激活，就能降解細(xì)胞內(nèi)蛋白而引起細(xì)胞凋亡[23]。Caspase-3 活化是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵核心步驟，Caspase-3 活化離不開其上游因子Caspase-8 或Caspase-9 的激活[24]。Cyt c無法穿過線粒體外膜，因此細(xì)胞質(zhì)中無法檢測到。如果Δψm降低，線粒體膜通透性則會增強(qiáng)，Cyt c 可穿過外膜釋放到胞質(zhì)中，催化Caspase-9 前體形成有活性的Caspase-9，進(jìn)而激活執(zhí)行細(xì)胞凋亡的Caspase-3的活性導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2 是公認(rèn)的細(xì)胞凋亡調(diào)控靶點(diǎn)，大多定位于線粒體外膜上，可以通過與Bax 拮抗，抑制Bax 游離的數(shù)量。降低Bcl-2 蛋白表達(dá)，會促使Bax 轉(zhuǎn)位到線粒體膜，進(jìn)而增強(qiáng)線粒體通透性，釋放Cyt c，激活Caspase-3的級聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[25-26]。Bcl-2/Bax 比值決定Caspase-3 的激活程度，比值越低，激活程度越高。本研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素可顯著升高HeLa 細(xì)胞Cyt c 和Bax 表達(dá)，降低Bcl-2、Bcl-2/Bax。本研究結(jié)果亦顯示，冬凌草甲素可顯著升高HeLa 細(xì)胞Caspase-3 和Caspase-9 活性。綜上所述，冬凌草甲素誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑激活有關(guān)。