于小林 張曉梅 張艷霞

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)臨床上一類病因尚不清楚的呈進(jìn)展性、彌漫性的間質(zhì)性肺病[1]，患者的中位生存期僅2～4年，發(fā)病率為每年3～9/10萬(wàn)[2]。目前，臨床上缺乏有效的治療手段。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是挖掘與預(yù)測(cè)藥物靶標(biāo)的重要方法，在探索中藥復(fù)方的起效成分與作用靶點(diǎn)方面具有較為廣泛的應(yīng)用。既往的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中對(duì)于疾病靶點(diǎn)的確定存在一定的局限性，疾病靶點(diǎn)與臨床實(shí)際的關(guān)聯(lián)較為欠缺?；谂R床大樣本基因芯片數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)手段，結(jié)合實(shí)際的臨床性狀與隨訪信息，對(duì)于中藥復(fù)方的抗纖維化靶點(diǎn)與潛在分子機(jī)制進(jìn)行探索，為進(jìn)一步的研究提供思路與線索。課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)，補(bǔ)氣活血通絡(luò)方具有明確的抗纖維化作用[3]，本次研究基于改進(jìn)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)具體其作用靶點(diǎn)進(jìn)一步挖掘。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)氣活血通絡(luò)方成分獲取及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

補(bǔ)氣活血通絡(luò)方的藥物組成為黃芪、金銀花、當(dāng)歸、甘草、穿山龍、石韋、浙貝母、瓜蔞、桔梗、枳殼、紅景天，通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取復(fù)方中所有中藥的成分，按照類藥性(drug likeness,DL)≥30% 以及口服利用度(oral bioavailability,OB)≥0.18作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出具有潛在藥物活性的成分，并獲取其相應(yīng)的靶點(diǎn)，同時(shí)刪去沒(méi)有靶點(diǎn)記錄的成分。

1.2 基因芯片數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

本次研究的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集來(lái)自于Gene Expression Omnibus (GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)，需要滿足以下納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)樣本來(lái)源于診斷為IPF的臨床病例；(2)樣本類型為肺組織活檢；(3)數(shù)據(jù)類型為基因芯片得出的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；(4)單個(gè)數(shù)據(jù)集的樣本量大于100例。下載符合納入標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)集的表達(dá)矩陣，將矩陣合并后進(jìn)行批次校正，減小系統(tǒng)誤差。

1.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)可以從整體層面得出相似表達(dá)模式的基因模塊并與臨床表型相關(guān)聯(lián)[4]，可以更宏觀地認(rèn)識(shí)基因的潛在功能。以基因芯片獲取的基因表達(dá)矩陣為基礎(chǔ)，以WGCNA包構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)計(jì)算各個(gè)基因表達(dá)量之間的相互關(guān)系，將整體基因表達(dá)譜歸為若干個(gè)基因模塊，每個(gè)模塊內(nèi)部的基因具有相似的表達(dá)模式，進(jìn)而計(jì)算每個(gè)模塊與臨床信息的皮爾森相關(guān)系數(shù)，從高相關(guān)性的模塊中選取相對(duì)于某一臨床性狀的關(guān)鍵基因，并將此關(guān)鍵基因與補(bǔ)氣活血通絡(luò)方的靶基因取交集，得出中藥復(fù)方調(diào)控肺間質(zhì)纖維化的潛在靶點(diǎn)。

1.4 生存相關(guān)基因的確定與功能注釋

為了進(jìn)一步判斷所獲得的靶點(diǎn)的臨床意義，本研究結(jié)合生存數(shù)據(jù)，確定每個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)τ诨颊呱鏁r(shí)間的價(jià)值。自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載具有生存時(shí)間的IPF數(shù)據(jù)集GSE27957與GSE28042，以此數(shù)據(jù)集為基礎(chǔ)，對(duì)前文得出的肺纖維化潛在靶點(diǎn)基因做單因素cox回歸分析，篩選出與生存時(shí)間相關(guān)的靶點(diǎn)基因。對(duì)于篩選出的基因，以limma包進(jìn)行差異分析，篩選出相對(duì)于此基因具有顯著表達(dá)差異的相關(guān)基因，行GO與KEGG富集分析，得出此基因的潛在生物學(xué)功能。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究以R語(yǔ)言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以WGCNA包構(gòu)建加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[5]，批次校正采用sva包的ComBat函數(shù)[6]，單因素cox回歸分析采用survival包[7]，假設(shè)檢驗(yàn)采用Wald檢驗(yàn)。差異分析采用limma包經(jīng)驗(yàn)貝葉斯法[8]，基因功能注釋以clusterProfiler包的GO與KEGG富集分析實(shí)現(xiàn)[9]。變量間的相關(guān)關(guān)系采用皮爾森相關(guān)性系數(shù)表示,P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)氣活血通絡(luò)方中活性成分及潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索補(bǔ)氣活血通絡(luò)方中每一味中藥的成分，對(duì)于符合DL≥30%,以及OB≥0.18篩選標(biāo)準(zhǔn)的活性成分，檢索其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，刪去無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分，最終得出132種活性成分，所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因共245種。

2.2 構(gòu)建加權(quán)共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，納入本次研究的數(shù)據(jù)集為GSE32537[10]與GSE47460[11]，共包含279例IPF樣本與158例對(duì)照樣本。將兩個(gè)數(shù)據(jù)集的表達(dá)矩陣合并后構(gòu)建加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，得到相應(yīng)的基因模塊(圖1)，每個(gè)模塊代表一組具有相似表達(dá)模式的基因。各個(gè)基因模塊以不同的顏色表示，灰色模塊代表基因不能歸入其他模塊。每個(gè)方框中第一行數(shù)字為相關(guān)系數(shù)，下方括號(hào)中的數(shù)字為P值。本研究著重考慮與IPF發(fā)病相關(guān)的基因，故在圖中“diagnosis”一列，選擇基因模塊與臨床性狀的皮爾森相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.4的模塊(分別為紅色red、紫色purple、藍(lán)綠色turquoise、藍(lán)色blue、黑色black、洋紅色magenta)，該部分模塊與IPF的診斷相關(guān)性較大。

圖1 基因模塊—臨床性狀關(guān)系圖

2.3 補(bǔ)氣活血通絡(luò)方有效成分對(duì)肺間質(zhì)纖維化作用靶點(diǎn)的確定

提取高相關(guān)性基因模塊的關(guān)鍵基因共372個(gè)，與補(bǔ)氣活血通絡(luò)方的靶點(diǎn)基因取交集，共得到13個(gè)基因(圖2)，此交集可以看做中藥復(fù)方對(duì)于肺間質(zhì)纖維化的靶點(diǎn)，同時(shí)繪制中藥復(fù)方的靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖3)，圖中紅色三角形代表13個(gè)基因，藍(lán)色矩形代表基因?qū)?yīng)的中藥復(fù)方單體成分，以TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的MOL編號(hào)表示。GSE27957[12]與GSE28042[13]共包含120例帶有生存數(shù)據(jù)的IPF樣本，基于其基因表達(dá)矩陣，從這13個(gè)基因中可以篩選出兩個(gè)生存相關(guān)的IPF靶基因(表1)，分別是骨髓細(xì)胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,MCL1)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth facter A,VEGFA)，兩個(gè)基因的風(fēng)險(xiǎn)比(hazard tatio,HR)均大于1，是肺纖維化發(fā)病的危險(xiǎn)因素。結(jié)合中藥復(fù)方靶點(diǎn)信息，構(gòu)建補(bǔ)氣活血通絡(luò)方調(diào)控肺間質(zhì)纖維化生存相關(guān)靶點(diǎn)圖(圖4)，可以看出此復(fù)方主要起效的成分為β-胡蘿卜素、木犀草素、槲皮素。

表1 篩選出生存相關(guān)的IPF靶基因

圖2 診斷相關(guān)基因與中藥復(fù)方靶點(diǎn)基因交集

圖3 中藥復(fù)方成分—肺纖維化靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖4 補(bǔ)氣活血通絡(luò)方調(diào)控肺間質(zhì)纖維化生存相關(guān)靶點(diǎn)圖

2.4 補(bǔ)氣活血通絡(luò)方對(duì)于肺纖維化生存相關(guān)機(jī)制的影響

通過(guò)對(duì)共表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，對(duì)MCL1與VEGFA進(jìn)行功能注釋，可以推斷出其參與的生物學(xué)機(jī)制與信號(hào)通路。MCL1的富集結(jié)果如表2所示，其生物學(xué)功能主要是對(duì)于生物活性因子的應(yīng)答以及細(xì)胞因子間的相互作用，信號(hào)通路主要富集于EGFR通路；VEGFA的富集結(jié)果如表3所示，其生物學(xué)功能除了對(duì)于血管生成的調(diào)控外，也參與了機(jī)體的免疫反應(yīng)，尤其是中性粒細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答，參與的信號(hào)通路主要為NF-κB通路、PI3K/Akt通路以及EGFR通路。

表2 MCL1功能注釋

表3 VEGFA功能注釋

3 討論

既往的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究大都從疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取對(duì)于某一疾病的相關(guān)基因，進(jìn)而以蛋白互做網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)潛在作用靶點(diǎn)，這種方法獲取的基因可能是來(lái)源于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)或者算法預(yù)測(cè)，臨床相關(guān)性較為欠缺，且容易受到數(shù)據(jù)庫(kù)收錄基因數(shù)目與數(shù)據(jù)庫(kù)算法的限制，對(duì)于疾病基因的認(rèn)識(shí)可能相對(duì)不完善。本研究基于實(shí)際臨床大樣本的基因芯片數(shù)據(jù)，創(chuàng)新性的以加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)為切入點(diǎn)，融合了兩個(gè)獨(dú)立的大樣本臨床試驗(yàn)的結(jié)果，獲取了IPF發(fā)病中的關(guān)鍵基因，具有一定的臨床可信度。進(jìn)而結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的中藥復(fù)方成分及靶點(diǎn)信息，確定了中藥復(fù)方對(duì)于IPF的作用靶點(diǎn)，最后基于源自另一獨(dú)立隊(duì)列的生存信息，以cox回歸分析為篩選手段，確定了與肺纖維化生存時(shí)間相關(guān)的靶點(diǎn)。整個(gè)分析過(guò)程所選取的臨床隊(duì)列均相互獨(dú)立，分析的結(jié)果可以相互驗(yàn)證，具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)的特征，對(duì)于中藥活性成分及作用靶點(diǎn)的研究一直是中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究的重要課題。生物信息學(xué)可以極大的提高中醫(yī)藥的研究效率，從整體基因組的特征出發(fā)，可以有針對(duì)性的獲取中藥對(duì)于特定表型或性狀的靶點(diǎn)信息。

MCL1是一類廣泛表達(dá)于人體各個(gè)組織中的抗凋亡蛋白[14]。MCL1通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，在調(diào)控細(xì)胞的分化與增殖，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等方面發(fā)揮重要的作用[15]。在肺間質(zhì)纖維化領(lǐng)域，關(guān)于MCL1的研究較為欠缺。本研究通過(guò)GO與KEGG功能注釋，發(fā)現(xiàn)MCL1在肺纖維化過(guò)程中主要參與的生物學(xué)通路為EGRF信號(hào)通路。EGFR在肺癌領(lǐng)域有深入的研究，針對(duì)EGFR的靶向用藥具有廣泛的應(yīng)用。在肺纖維化領(lǐng)域，Epstein SG等[16]發(fā)現(xiàn)肺纖維化患者的成纖維細(xì)胞中EGFR表達(dá)異常，具有顯著的促纖維化作用。本研究也同樣支持EGFR為肺纖維化的危險(xiǎn)因素，并且與患者的生存時(shí)間密切相關(guān)。補(bǔ)氣活血通絡(luò)方中的活性成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)MCL1的抗凋亡作用，從而抑制成纖維細(xì)胞的分化增殖而起到抗纖維化作用。

VEGFA在廣泛參與了肺纖維化的進(jìn)程，以VEGFA為治療靶點(diǎn)可以顯著改善肺纖維化病情，對(duì)此中西醫(yī)相關(guān)研究均有報(bào)道[17-18]。需要注意的是，GO分析中顯示VEGFA不僅參與了血管生成的生物學(xué)過(guò)程，還對(duì)中性粒細(xì)胞的免疫反應(yīng)有調(diào)節(jié)作用，近期的一項(xiàng)研究也報(bào)道，VEGFA可以調(diào)控中性粒細(xì)胞在炎癥區(qū)域的募集與功能[19]。在肺纖維化領(lǐng)域尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，關(guān)于VEGFA的免疫調(diào)節(jié)作用尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，該富集結(jié)果為肺纖維化中的免疫相關(guān)研究提供了新的思路與方向。本研究顯示，VEGFA的共表達(dá)基因顯著富集于NF-κB通路、PI3K/Akt通路以及EGFR通路，均為肺纖維化研究中的經(jīng)典通路。補(bǔ)氣活血通絡(luò)方以VEGFA為作用靶點(diǎn)的抗纖維化作用，可能是基于調(diào)節(jié)VEGFA參與的血管生成與免疫應(yīng)答而實(shí)現(xiàn)，主要涉及的通路為NF-κB通路、PI3K/Akt通路以及EGFR通路。

前期研究顯示，補(bǔ)氣活血通絡(luò)方可以顯著改善肺組織纖維增殖，改善大鼠肺功能，維持肺泡表面活性物質(zhì)的正常分泌，具有明確的抗纖維化作用[20]。本次研究以生物信息學(xué)為手段，進(jìn)一步挖掘補(bǔ)氣活血通絡(luò)方對(duì)于肺間質(zhì)纖維化治療的潛在靶點(diǎn)，確定了復(fù)方中的相關(guān)活性成分可以通過(guò)靶向MCL1、VEGFA基因而起到抗纖維化作用。前期實(shí)驗(yàn)研究也同樣證實(shí)，補(bǔ)氣活血通絡(luò)方對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路有明顯的抑制作用[21]，從免疫組織化學(xué)層面也印證了本次數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，補(bǔ)氣活血通絡(luò)方以MCL1、VEGFA為作用靶點(diǎn)，作用于NF-κB通路、PI3K/Akt通路以及EGFR通路從而起到抗纖維化作用，可與前期實(shí)驗(yàn)研究相互佐證，并推測(cè)出此復(fù)方中可能起效的關(guān)鍵成分。本文是對(duì)于傳統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法學(xué)改進(jìn)，使其更貼合臨床樣本，但是容易受到所納入基因芯片質(zhì)量與臨床信息準(zhǔn)確性的影響，與傳統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相比各有優(yōu)缺點(diǎn)。