段國敏 李田園 田 敏 王彩霞 張 瑩

(1中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2南京林業(yè)大學風景園林學院，江蘇 南京 210037)

實時熒光定量 PCR (real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)是研究基因表達的常用方法，該技術具有耗時短、定量準確、靈敏度高、重復性好、高通量等特點[1-3]，但表達分析的結果經(jīng)常受不同樣品RNA 提取質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率等影響。為了消除這些偏差，有必要選擇合適的內(nèi)參基因進行校正和標準化[4]。理想的內(nèi)參基因在不同的試驗條件下都會穩(wěn)定表達，其表達水平與目標基因的表達水平相近[5-7]。在前基因組時代，研究者認為維持生物體生命活動或參與生物體基本代謝的蛋白基因(ACT)、微管蛋白基因(TUB)、多聚泛素酶基因(UBC)和3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)等基因產(chǎn)物，能在不同的細胞中或不同生理狀態(tài)下穩(wěn)定表達，適合作為內(nèi)參基因[8-10]。然而，根據(jù)近幾年的研究表明，在不同的試驗條件下看家基因表達穩(wěn)定性會有所變化[11-14]。因此，在特定的試驗條件下有必要篩選合適的內(nèi)參基因。

扇脈杓蘭(Cypripedium japonicum) 為蘭科(Orchidaceae)杓蘭屬(Cypripedium)多年生草本植物，是我國一級保護植物[15]，為東亞地區(qū)特有種，其花大色艷，根狀莖可入藥，用于調(diào)經(jīng)、祛風鎮(zhèn)痛等[16]，具有較高的觀賞和藥用價值。扇脈杓蘭種子敗育嚴重，自然狀態(tài)下種子萌發(fā)率較低，種群生存狀態(tài)較差[17-18]。隨著分子生物學的迅速發(fā)展，利用分子生物學技術揭示扇脈杓蘭種胚發(fā)生的關鍵基因并對其進行開發(fā)利用，對推動扇脈杓蘭分子育種具有重要意義，但目前鮮見有關扇脈杓蘭內(nèi)參基因的研究，可能會影響RTqPCR 基因表達分析的準確性。

為了揭示扇脈杓蘭種子敗育的分子機理，本研究在前期獲得扇脈杓蘭不同發(fā)育時期種子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎上，篩選了ACT3、EF1、RPL26B、TIF3I1、SAMDC、CYP22、PP2A3、TUBB3、RPS4、UBC2、UPL1、RAN1 共12 個看家基因作為候選內(nèi)參基因，并利用geNorm[19]、NormFinder[20]和BestKeeper[21]軟件進行內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析，旨在找出能夠在扇脈杓蘭不同組織和不同發(fā)育階段的種子中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，提高扇脈杓蘭RT-qPCR 表達分析的準確性，同時為其他杓蘭屬植物內(nèi)參基因的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為浙江省西天目山國家級自然保護區(qū)內(nèi)海拔1 120 m 處林下的野生扇脈杓蘭，2019年4月對其野生居群進行人工授粉后，分別采取扇脈杓蘭幼根、莖、葉、唇瓣以及5 個不同發(fā)育時期的果實(授粉后0、20、40、60、80 d)，用小刀沿果實縱向切開，用刀背將胎座上正在發(fā)育的種子迅速刮到凍存管。每個樣品設3次生物學重復，將凍存管中的樣品迅速放入液氮，置于-80℃冰箱備用。

1.2 總RNA 的提取及cDNA 合成

采用DP441 RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取各樣品的總RNA，使用Q6000-美國Quawell 超微量可見分光光度計(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)進行RNA 濃度和純度的測定，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。將符合要求的RNA 用于cDNA的合成。

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒NovoStart? Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(上海近岸蛋白科技有限公司)的操作步驟，以各樣品中1 μg 總RNA 為模板，將各樣品的RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA 第一鏈，反應獲得的產(chǎn)物可直接用于PCR 或-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 內(nèi)參基因的選擇及RT-qPCR 引物的設計

根據(jù)本研究前期對扇脈杓蘭不同發(fā)育時期種子的轉(zhuǎn)錄組測序結果，選取ACT3、EF1、RPL26B、TIF3I1、SAMDC、CYP22、PP2A3、TUBB3、RPS4、UBC2、UPL1、RAN1 基因作為候選內(nèi)參基因。根據(jù)RT-qPCR 引物設計原則，利用Primer 3．0 分別對這12 個內(nèi)參基因進行引物設計。所有引物均由杭州有康生物技術有限公司合成。

1.4 引物特異性檢測

以各個樣品等量混勻的cDNA 為模板進行PCR 擴增。反應體系為25 μL，包括2 ×Taq Master Mix 12．5 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O 9．5 μL。反應程序：94℃預變性90 s；94℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃以每60 s 延伸1 kb，共30 個循環(huán)；72℃延伸5 min。用1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物的特異性。

1.5 RT-qPCR 及擴增效率檢測

將各樣品的cDNA 等量混勻后，稀釋10 倍作為模板，用上海近岸蛋白科技有限公司的NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus 熒光定量試劑盒以及實時熒光定量PCR 儀進行RT-qPCR 試驗。反應體系為20 μL，包括2×NovoStart? SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL、ROX 0．4 μL、Rnase Free Water 6．6 μL。按照兩步法進行PCR 擴增，每個樣品3 次技術性重復。擴增程序：95℃預變性1 min；95℃變性20 s，60℃退火30 s，共40 個循環(huán)；65～95℃溶解曲線分析。

將等量混勻的cDNA 稀釋成5 個濃度梯度，以10倍稀釋，稀釋后的濃度分別為10-1、100-1、1 000-1、10 000-1、100 000-1，用不同濃度的cDNA 為模板進行RT-qPCR，制作標準曲線，并利用E ＝(10-1/slope-1)×100%計算候選內(nèi)參基因引物的擴增效率。用R2估測標準曲線回歸方程的可靠程度。

1.6 內(nèi)參基因的RT-qPCR 擴增與數(shù)據(jù)處理和分析

用稀釋10 倍的各樣品混合物cDNA 為模板，對12個內(nèi)參基因進行RT-qPCR 擴增，通過統(tǒng)計各內(nèi)參基因在不同組織和不同發(fā)育時期種子的Ct 值來檢測各內(nèi)參基 因 的 表 達 量。利 用 geNorm、 NormFinde 和BestKeeper 3 個軟件分別對12 個候選內(nèi)參基因在扇脈杓蘭不同組織和不同發(fā)育時期的種子中表達的穩(wěn)定性進行分析，篩選表達相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

1.7 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證

為進一步驗證所篩選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，在不同發(fā)育時期種子中，用穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因?qū)? 個目的基因SERK2 和ASK1 進行相對表達量分析。

2 結果與分析

2.1 RNA 樣品質(zhì)量的檢測

檢測所有樣品RNA 濃度和純度發(fā)現(xiàn)，所測樣品的A260/A280 均在2．0 左右。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示(圖1)，扇脈杓蘭每個組織的RNA 電泳圖譜清晰，且28S rRNA 比18S rRNA 的亮度高。表明所提取的RNA 純度高、完整性好，可用于后續(xù)試驗。

2.2 引物特異性和擴增效率檢測

根據(jù)扇脈杓蘭轉(zhuǎn)錄組的測序結果，在NCBI 對12個候選內(nèi)參基因以及2 個目的基因的序列進行TBLASTX 分析，結果如表1 所示，這些基因與小蘭嶼蝴蝶蘭[Phalaenopsis equestris(Schauer) Rchb． f．]中相關同源基因有很高的相似性和一致性。如TUBB3 的序列與小蘭嶼蝴蝶蘭同源基因XP_020586417 的相似性高達100%、一致性為98．36%，這些基因中序列相似性最低的是RAN1(71%)，但RAN1 序列一致性最高，達98．84%。其他10 個候選基因與相關基因的相似性、一致性分別為88%～99%、80．43%～97．61%。

表1 扇脈杓蘭候選內(nèi)參基因和目的基因的比對信息Table 1 Description of candidate reference genes and target gene for RT-qPCR in C. japonicum

以9 份材料等量混勻的cDNA 為模板，進行RTqPCR 分析。1．5%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示(圖2)，14個基因的擴增產(chǎn)物條帶單一，與預期結果大小一致，不存在引物二聚體，且候選內(nèi)參基因引物溶解曲線只有一條主峰，沒有其他雜峰的出現(xiàn)(圖3)，表明引物特異性好。應用標椎曲線法對引物擴增效率的分析如表2 所示，擴增效率為95．07%～108．55%，其中，PP2A3 的擴增效率 最 低(95．07%)，TIF3I1的擴增效率最高(108．55%)，且相關系數(shù)R2在0．988 5～0．999 9 之間。

圖2 候選內(nèi)參基因PCR 擴增產(chǎn)物電泳檢測Fig.2 Electrophoresis of the PCR products of candidate reference genes

2.3 候選內(nèi)參基因的Ct 值

Ct 值用于候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性表達分析，由圖4可知12 個候選內(nèi)參基因Ct 值平均值在20 ～30 之間，其中EF1 的平均Ct 值最小，為23．063 5，平均表達水平最高；UPL1 的平均Ct 值最高，其平均表達水平最低；其他各候選內(nèi)參基因的平均Ct 值在23．063 5 ～25．378 0 之間，表達水平相差不大。

2.4 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

2．4．1 geNorm 分析 geNorm 程序是根據(jù)計算所得M 值來表示候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性，M 值越小，候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好[22]。由圖5 可知，在不同試驗條件下，候選內(nèi)參基因的M 值均在1．5 以下，說明這些基因表達相對穩(wěn)定，在以全部樣品為研究材料時，UBC2 和UPL1 的M 值最小，表現(xiàn)出最高的穩(wěn)定性，其次為TUBB3 和TIF3I1，而EF1 的M 值最高，表達穩(wěn)定性最低。在不同組織樣品中，EF1、RPL26B穩(wěn)定性較好。當以不同發(fā)育時期的種子為研究對象時，TUBB3 和SAMDC的穩(wěn)定性最佳。不同組織和不同發(fā)育時期的種子樣品中穩(wěn)定性最低的基因分別為SAMDC和ACT3。geNorm 軟件分析結果表明在不同試驗條件下候選內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性存在明顯差別。

此外，geNorm 還根據(jù)候選內(nèi)參基因標準化因子的配對差異分析(Vn/n+1)得到內(nèi)參基因的最佳數(shù)目，軟件默認Vn/n+1＝0．15，當Vn/n+1＜0．15 時表明n 個內(nèi)參基因已經(jīng)穩(wěn)定，沒有必要引入第n+1 個基因[22]。如圖6 所示，在以全部樣品為材料時，V4/5＝0．115，表明分析不同組織和發(fā)育時期種子需要引入4 個內(nèi)參基因進行校正，即UBC2、UPL1、TUBB3、TIF3I1。對不同組織進行分析時，V2/3＝0．09，表明內(nèi)參基因的最佳組合數(shù)目為2 個，無需引入第3 個內(nèi)參基因進行標準化。以不同發(fā)育階段種子為對象時，V2/3＝0．138， 2 個內(nèi)參基因就能夠滿足其標準化。

表2 RT-qPCR 分析中候選內(nèi)參基因相關參數(shù)Table 2 Related parameters of candidate internal reference genes in RT-qPCR analysis

2．4．2 NormFinder 分析 NormFinder 軟件基于組內(nèi)方差和組間方差，根據(jù)候選基因的表達穩(wěn)定值選出穩(wěn)定性最好的基因，表達穩(wěn)定值越小基因越穩(wěn)定。由表3 可知，TIF3I1 和CYP22 在全部樣品和不同發(fā)育時期的種子中表達穩(wěn)定性最佳，穩(wěn)定值分別為0．203、0．322 和0．214、0．133。以不同組織為材料時，UBC2和PP2A3 最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0．151、0．178。在三組數(shù)據(jù)中，穩(wěn)定值最高的基因分別是EF1、SAMDC、ACT3，表明他們的表達穩(wěn)定性低。其他候選內(nèi)參基因在NormFinder 軟件中穩(wěn)定性排名與geNorm 軟件的結果相似。

2．4．3 BestKeeper 分析 BestKeeper 程序通過計算樣品Ct 值的標準差(SD)、變異系數(shù)(CV)和基因間相關系數(shù)(r)來判斷內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，相關系數(shù)越大、標準差和變異系數(shù)越小，表達越穩(wěn)定[8]。該程序以SD ＝1 為臨界值，當SD＞1 時表明不適合做內(nèi)參基因，反之則表示基因的表達穩(wěn)定性好。BestKeeper 軟件只能對10 個內(nèi)參基因進行比較，因此本試驗基于geNorm、NormFinder 程序?qū)?2 個候選內(nèi)參基因的篩選結果，選取穩(wěn)定性較好的10 個候選內(nèi)參基因用于BestKeeper程序分析，結果如表4 所示。CYP22、TUBB3、RPS4、UBC2 在9 個試驗樣品中能夠穩(wěn)定表達，且CYP22 穩(wěn)定性最好。在4 個不同組織中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性從高到低依次為RAN1、PP2A3、CYP22、TIF3I1、RPS4、EF1、UBC2、UPL1、RPL26B。在5 個不同發(fā)育時期的種子中UBC2、TUBB3、SAMDC基因最穩(wěn)定。其他候選內(nèi)參基因的SD 均大于1，不適合做內(nèi)參基因。

圖3 候選內(nèi)參基因PCR 產(chǎn)物的溶解曲線Fig.3 The melting curve of the candidate reference gene

圖4 候選內(nèi)參基因的Ct 值Fig.4 Raw Ct values for candidate reference genes in all data sets form RT-qPCR

BestKeeper 分析結果與geNorm 和Normfinder 分析結果差異明顯，利用Excel 對3 個軟件分析的穩(wěn)定內(nèi)參基因進行幾何平均數(shù)的排名(表5)。在全部樣品中內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序為CYP22、UBC2、TIF3I1、TUBB3；不同組織中基因穩(wěn)定性從高到低排名為PP2A3、TIF3I1、RAN1、UBC2、RPS4、EF1、RPL26B、UPL1、CYP22；以不同發(fā)育時期的種子為材料時，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因的排序為TUBB3、UBC2、SAMDC。根據(jù)geNorm 軟件分析，在全部樣品中最適內(nèi)參基因為4個，不同組織和發(fā)育時期的最適內(nèi)參基因均為2 個，因此3 組數(shù)據(jù)最穩(wěn)定內(nèi)參基因分別為CYP22、UBC2、TUBB3、RPS4；PP2A3、TIF3I1；TUBB3、UBC2。

2．4．4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證 以胚胎發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用的SERK2 和ASK1 基因為目的基因，通過在不同發(fā)育時期的種子中篩選出的穩(wěn)定內(nèi)參基因UBC2 和TUBB3 以及不穩(wěn)定的ACT3 基因?qū)δ康幕蜻M行相對表達量的計算，進一步驗證所篩選的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，結果如圖7 所示。以UBC2 和TUBB3 及其組合基因作為內(nèi)參基因時，ASK1 和SERK2 的相對表達變化趨勢相一致，而以穩(wěn)定性較差的ACT3 基因作為內(nèi)參基因時，ASK1 和SERK2 的相對表達發(fā)生了改變。由此可知，不合適的內(nèi)參基因會導致目的基因表達水平有偏差。

3 討論

圖5 利用geNorm 軟件分析內(nèi)參基因的平均表達穩(wěn)定值(M)Fig.5 Average expression stability value(M)of reference genes evaluated by geNorm

圖6 通過geNorm 軟件分析內(nèi)參基因的配對變異值(V)Fig.6 Pairwise variation(Ⅴ)of reference genes generated by geNorm

表3 NormFinder 程序?qū)蜻x內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序Table 3 Candidate reference genes ranked by NormFinder

表4 BestKeeper 程序?qū)蜻x內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序Table 4 Candidate reference genes ranked by BestKeeper

表5 3 種分析軟件的總分排名Table 5 The rank of total score by three analysis software

目前已有關于植物不同組織和發(fā)育時期內(nèi)參基因篩選的研究報道。如張崗等[23]篩選鐵皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)不同組織最適內(nèi)參基因為EF-1α和18SrRNA。李晗等[24]在羽衣甘藍(Brassica oleraceavar． acephala DC．)的不同組織和不同發(fā)育時期柱頭中發(fā)現(xiàn)，Tub-α6 在不同組織中穩(wěn)定表達，在不同發(fā)育時期的柱頭中，ACT穩(wěn)定表達。劉洪峰等[25]在牡丹(Paeonia suffruticosaAndr．)不同發(fā)育階段種子和花瓣組織內(nèi)參基因的篩選中發(fā)現(xiàn)，RPS9 和PUF1639 在不同發(fā)育階段種子中表達最穩(wěn)定。本研究中，PP2A3、TIF3I1 基因在不同組織中表達最穩(wěn)定，以不同發(fā)育時期的種子為研究對象時，TUBB3、UBC2基因表達最穩(wěn)定，這與上述已有研究結果不一致，這可能是由于試驗樣品種類和方法等不同造成的最穩(wěn)定內(nèi)參基因的不同。

圖7 ASK1 和SERK2 的相對表達量Fig.7 Relative expression levels of ASK1 and SERK2

根據(jù)內(nèi)參基因在3 個軟件中的綜合排名得出，以全部樣品為材料時，CYP22、UBC2、TIF3I1、RPS4 和TUBB3 表達穩(wěn)定性最好，PP2A3、TIF3I1 基因在不同組織中表達最穩(wěn)定；以不同發(fā)育時期的種子為研究對象時，TUBB3 和UBC2 基因表達最穩(wěn)定。由此可見，有必要針對不同的試驗條件和材料選擇不同的內(nèi)參基因。林榕燕等[26]對“黃金小神童”花器官不同部位和不同雜交蘭(Cymbidium hybrid)品種葉片的研究發(fā)現(xiàn)，ChUBQ、ChEF-1α、ChTUB、ChACT及ChUBQ和ChEF-1α基因組合可作為內(nèi)參基因，這與扇脈杓蘭不同組織的內(nèi)參基因存在差異，Li 等[27]發(fā)現(xiàn)ACT在水稻種子和不同組織中均能穩(wěn)定表達，馬璐琳等[28]關于西南鳶尾(Iris bulleyanaDykes)和白花變型西南鳶尾(Ⅰ.bulleyanaDykes f．a(chǎn)lbaY． T． Zhao)花蕾組織的研究發(fā)現(xiàn)，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為ACT，但其在扇脈杓蘭種子和不同組織中穩(wěn)定性較差。這說明不同物種和不同組織器官中內(nèi)參基因不存在通用性。

通過3 個軟件對候選內(nèi)參基因在全部樣品、不同組織和不同發(fā)育時期種子的表達穩(wěn)定性分析結果得出，候選內(nèi)參基因在geNorm 和NormFinder 分析軟件中排名相似，但BestKeeper 分析結果與geNorm 和NormFinder 分析結果存在明顯差異，這與蔣婷婷等[29]對石蒜屬(Lycoris)不同組織、不同花發(fā)育期和不同雜交種的幼鱗莖進行最適內(nèi)參基因篩選的分析結果一致，可能是軟件算法不同導致的內(nèi)參基因排序的不同。如BestKeeper 中排名第2 的TUBB3，在geNorm 和NormFinder 中排名第3 和第6，其穩(wěn)定值符合內(nèi)參基因的要求，也可作為內(nèi)參基因。因此，需要進一步驗證排名靠前內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

研究表明，單一內(nèi)參基因可能對試驗結果有影響，一般選擇2 個或多個基因作為內(nèi)參基因[30-31]，這有助于調(diào)整系統(tǒng)偏差，更有利于得到準確的基因表達定量結果[32]。Park 等[33]對在脅迫作用下的4 種番薯[Ipomoea batatas(L．)Lam．]品種進行候選內(nèi)參基因的篩選時，使用內(nèi)參基因ARF、ARF和COX組合以及不穩(wěn)定內(nèi)參基因TUB分別對IbLEA14 和swpa2 基因進行表達驗證，結果顯示單個最佳內(nèi)參ARF與ARF和COX組合的表達水平有微小差異，而以TUB為內(nèi)參基因的表達水平則呈現(xiàn)相反的結果。本研究對目的基因ASK1、SERK2 在不同發(fā)育時期的種子中進行表達分析，發(fā)現(xiàn)利用2 個內(nèi)參基因在單獨定量及其組合定量方面差異較小，表明利用2 個內(nèi)參基因組合進行基因表達定量分析完全可行。

4 結論

本研究共選取12 個候選內(nèi)參基因，研究其在扇脈杓蘭不同組織和不同發(fā)育時期種子的表達情況，分析了各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。結果表明，12 個候選內(nèi)參基因在不同組織和不同發(fā)育時期種子中均有表達，但表達量存在差異，在以全部樣品為材料時，CYP22、UBC2、TUBB3、RPS4 表達穩(wěn)定性好；以不同組織為研究對象時，PP2A3、TIF3I1 表達最穩(wěn)定；以不同發(fā)育時期的種子為材料時，TUBB3、UBC2 表達最穩(wěn)定。隨著分子生物學的迅速發(fā)展，可以借助全基因組測序來探究更多未知且恒定表達的內(nèi)參基因。本研究結果不僅提高了扇脈杓蘭基因表達分析的準確性，也為其他杓蘭屬植物內(nèi)參基因的篩選提供了理論參考。