涂 瑞， 曾 鈺， 彭忠利， 高彥華， 吳華卓， 柏 雪

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041）

目前，我國飼用蛋白質(zhì)資源嚴(yán)重短缺（劉長松等，2015），而菜籽粕和棉籽粕產(chǎn)量高、價格低廉，而且蛋白質(zhì)含量均在35%以上 （余勃等，2009），是潛力較大的蛋白質(zhì)飼料資源。 但菜籽粕和棉籽粕中含有硫葡萄糖甙、單寧、游離棉酚、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子（Khattab 等，2010），且蛋白質(zhì)分子較大（Aider 等，2011），纖維物質(zhì)含量較高，不僅影響其作為飼料原料的安全性、適口性和營養(yǎng)價值，還極大地限制了在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用。 發(fā)酵飼料的興起和發(fā)酵工藝的完善為該問題提供了解決思路。國內(nèi)外主要采用物理法、 化學(xué)脫毒和微生物發(fā)酵等方法降低棉籽粕和菜籽粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子（Yang 等，2001），物理法和化學(xué)脫毒因效果單一、成本高而難以推廣應(yīng)用， 而微生物發(fā)酵法不僅安全、脫毒率高，而且成本低、工藝簡單。微生物發(fā)酵不僅能降低抗?fàn)I養(yǎng)因子和霉菌毒素的含量， 還能提高其營養(yǎng)價值，將植物蛋白轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，降低肽鏈長度，平衡氨基酸的組成（付敏等，2013），改善適口性，提高消化酶活性，調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡，提高消化利用率，降低生產(chǎn)成本，對緩解我國蛋白飼料匱乏和促進(jìn)畜牧業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展具有重要意義（吳正可等，2018；Liu 等，2008）。

近年來， 研究者利用單一菌種對棉籽粕或菜籽粕固態(tài)發(fā)酵做了大量的研究， 發(fā)現(xiàn)單一菌種對其營養(yǎng)價值的改善效果不明顯， 且不便在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。 而復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵能產(chǎn)生更多的酶， 達(dá)到單一菌種所不具備的協(xié)同效果與互補(bǔ)作用（Madeira 等，2012）。研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉能產(chǎn)生多種酶，是重要的工業(yè)酶制劑生產(chǎn)菌種，不僅酶的產(chǎn)量、活性較高，而且生長旺盛、發(fā)酵周期短，是美國FAD 認(rèn)證的安全菌種（Gamarra 等，2010；Schuster等，2002）；米曲霉能有效地將淀粉、纖維素降解為易被利用的單糖等物質(zhì)，合成菌體蛋白，但米曲霉只產(chǎn)生外切水解肽酶，對于蛋白質(zhì)的利用有限（高曉梅等，2014）； 而枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生活性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)內(nèi)切肽酶、α-淀粉酶和脂肪酶 （劉曉艷等，2018）， 同時還能分泌降解飼料中復(fù)雜碳水化合物的酶，不僅能夠提高飼料中氨基酸含量，還能彌補(bǔ)其他菌種的不足（張玉誠等，2016）。目前利用黑曲霉、 米曲霉和枯草芽孢桿菌進(jìn)行混合固態(tài)發(fā)酵的研究鮮有報道。鑒于此，本試驗(yàn)以棉籽粕和菜籽粕為原料，利用復(fù)合菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，探討固態(tài)發(fā)酵對雜粕營養(yǎng)價值和安全性的影響， 為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料的研發(fā)及棉籽粕和菜籽粕的合理利用提供實(shí)用技術(shù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 發(fā)酵底物：棉籽粕、菜籽粕，由四川新通達(dá)生物飼料科技有限公司提供。

發(fā)酵菌種： 復(fù)合菌種由黑曲霉（CICC2139AS3.324，1.10×1010～ 1.15×1010cfu/g）、米曲霉（CICC2329 滬釀 3.042，1.10×1010～ 1.14×1010cfu/g，）、枯草芽孢桿菌（BNCC188080，1.90×1010～2.10×1010cfu/g）組成。 黑曲霉、米曲霉由濟(jì)寧玉園生物科技有限公司提供； 枯草芽孢桿菌由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計 在特定條件下通過復(fù)合菌種對雜粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵， 采用多點(diǎn)取樣法分別采集發(fā)酵前后的樣品，以相同的方法測定營養(yǎng)成分、抗?fàn)I養(yǎng)因子、氨基酸含量、霉菌毒素含量和酶活性，對發(fā)酵雜粕的營養(yǎng)價值和生物安全進(jìn)行評定。

1.3 發(fā)酵方法及條件 參考本課題組前期優(yōu)化的試驗(yàn)條件，在四川新通達(dá)生物飼料科技有限公司進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵混合物按以下條件混合：棉籽粕:菜籽粕=1:1；料水比=1:1；黑曲霉:米曲霉:枯草芽孢桿菌=5:5:2；接種量：5.92×107～ 6.26×107cfu/g。

將發(fā)酵混合物混合均勻后平鋪在恒溫發(fā)酵床（專利申請?zhí)枺篊N201920581366.0 已授權(quán)） 中，（35±2）℃靜置發(fā)酵 4 d，每天翻料一次。

1.4 樣品的采集與測定

1.4.1 樣品的采集 將發(fā)酵底物混合均勻后，置于發(fā)酵床上，隨機(jī)選擇10 個點(diǎn)采集混合樣，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，65 ℃烘干，粉碎過40 目篩，保存待測。 在發(fā)酵結(jié)束后，在每個發(fā)酵床隨機(jī)選擇10 個點(diǎn)采集發(fā)酵樣品，低溫保存迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，65 ℃烘干，粉碎過40 目篩，封裝標(biāo)號用于常規(guī)營養(yǎng)成分和霉菌毒素的測定。

1.4.2 常規(guī)營養(yǎng)成分的測定 干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、鈣和磷的含量參照張麗英（2003）的方法測定， 中性洗滌纖維、 酸性洗滌纖維的含量參照Van Soest 等（1991）采用濾袋法進(jìn)行測定；總能采用德國IKA 等溫氧彈量熱儀（C6000）測定。

1.4.3 氨基酸含量的測定 氨基酸含量參照 《飼料中含硫氨基酸的測定 離子交換色譜法》（GB/T 15399-2018）中氧化水解法測定。

1.4.4 霉菌毒素含量的測定 黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量分別參照《飼料中黃曲霉毒素B1 的測定 酶聯(lián)免疫吸附法》（GB/T 17480-2008）、《飼料中玉米赤霉烯酮的測定》（GB/T 19540-2004）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》（GB/T 5009.111-2016）中的方法測定。

1.4.5 抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的測定 游離棉酚、單寧、植酸含量分別參照《飼料中游離棉酚的測定方法》（GB/T 13086-1991）、《飼料中單寧的測定 分光光度法》（GB/T 27985-2011）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中植酸的測定》（GB 5009.153-2016） 中的方法測定。

1.4.6 酶活性的測定 蛋白酶活性參照 《蛋白酶活力測定法》（SB/T 10317 ～ 1999） 中福林酚法進(jìn)行測定；α-淀粉酶活性和脂肪酶活性分別采用南京建成生物工程研究所的α-淀粉酶試劑盒和脂肪酶試劑盒測定，按說明書操作進(jìn)行測定，操作室室內(nèi)溫度在20 ℃左右。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016 初步整理后，調(diào)用SPSS 24.0 軟件中成對樣本t 檢驗(yàn)來完成配對樣本平均數(shù)的差異顯著性檢驗(yàn)， 結(jié)果以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差” 表示，P ＜0.05 表示差異顯著，P ＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵對雜粕營養(yǎng)組成的影響 由表1 可知，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后干物質(zhì)含量無顯著變化（P ＞ 0.05）；發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)、粗灰分、鈣、磷含量分別顯著提高了15.19%、11.67%、18.18%、22.43%，中性洗滌纖維含量顯著降低了15.47%；酸性洗滌纖維含量和總能無顯著變化（P ＞0.05）。

2.2 復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵對雜粕氨基酸含量的影響由表2 可知， 與發(fā)酵前相比， 發(fā)酵后除谷氨酸外（P ＞ 0.05），總氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸及其他種類的氨基酸含量均顯著提高 （P ＜0.05），其中賴氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和總必需氨基酸含量分別提高了30.93%、23.97%、22.07%、20.56%和21.36%，胱氨酸有顯著提高的趨勢（P =0.053），精氨酸含量降低，但差異不顯著（P ＞ 0.05）。

表1 固態(tài)發(fā)酵雜粕營養(yǎng)成分的變化（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

表2 固態(tài)發(fā)酵雜粕氨基酸含量的變化（干物質(zhì)基礎(chǔ)） %

2.3 復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵對雜粕霉菌毒素和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響 由表3 可知，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量分別降低了 21.25%和 28.56%（P ＜ 0.001）， 而脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在發(fā)酵后未檢出。與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后游離棉酚、 單寧和植酸的含量分別降低了51.51%、21.21%和 23.22%（P ＜ 0.05）。

表3 固態(tài)發(fā)酵對雜粕霉菌毒素和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響

2.4 復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵對雜粕酶活性的影響 由表4 可知，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后蛋白酶活性顯著提高了 115.21%（P ＜ 0.001）， 脂肪酶活性有顯著提高的趨勢（P =0.083），而淀粉酶活性無顯著變化（P ＞ 0.05）。

表4 固態(tài)發(fā)酵對雜粕酶活性的影響

3 討論

3.1 復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵對雜粕營養(yǎng)組成的影響微生物發(fā)酵是改善棉籽粕和菜籽粕營養(yǎng)價值的有效途徑之一。 吳正可等（2018）利用篩選出的嗜酸乳桿菌與釀酒酵母、 枯草芽孢桿菌對菜籽粕進(jìn)行混菌發(fā)酵，發(fā)酵后菜籽粕呈黃褐色蓬松狀，粗蛋白質(zhì)含量提高了18.30%。 孫林等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，菜籽粕經(jīng)混菌發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)的含量由36.20%提升到42.50%，顯著提高了多肽的含量，降低了植酸和單寧的含量。 Sun 等（2012）通過添加枯草芽孢桿菌和木瓜蛋白酶發(fā)酵棉籽粕， 結(jié)果表明發(fā)酵顯著提高了粗蛋白質(zhì)和粗灰分的含量， 顯著降低了粗脂肪和粗纖維的含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵4 d 后粗蛋白質(zhì)由43.06%提升至49.60%，提高了15.19%，與豆粕的蛋白水平相當(dāng)，中性洗滌纖維含量降低了15.47%，與上述研究結(jié)果一致。 可能是發(fā)酵過程中微生物將雜粕中的粗蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為動物更易利用的菌體蛋白等物質(zhì)， 同時也消耗了碳水化合物，造成發(fā)酵雜粕中干物質(zhì)的損失，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的“濃縮效應(yīng)”（吳正可等，2018），最終導(dǎo)致發(fā)酵雜粕粗蛋白質(zhì)含量的升高。 發(fā)酵后發(fā)酵雜粕的粗灰分提高了11.67%，可能是發(fā)酵過程中微生物利用了雜粕中的有機(jī)物， 使得粗灰分的相對含量升高，與Chi 等（2016）的研究結(jié)果一致。從形態(tài)學(xué)觀察，雜粕經(jīng)過4 d 的發(fā)酵后，表面由光滑變得疏松多孔，且散發(fā)著濃郁的香味?？赡苁俏⑸锓置诘拿笇w維結(jié)構(gòu)造成破壞， 這也是發(fā)酵后纖維物質(zhì)含量降低的重要原因之一， 而疏松多孔的結(jié)構(gòu)也增加了消化酶的接觸面積 （Gilani 等，2005），使得雜粕發(fā)酵效果更好，更有利于動物的消化吸收（付敏等，2013）。

研究表明， 黑曲霉和枯草芽孢桿菌都具有良好的產(chǎn)植酸酶能力，通過植酸酶水解植酸，將其中的植酸磷釋放出來供動物吸收， 不僅能降低植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，還能減少無機(jī)磷的添加。本試驗(yàn)中雜粕發(fā)酵后磷含量提高了22.43%，而植酸的含量降低了23.22%，與鮑振國（2013）利用枯草芽孢桿菌對棉籽粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，總磷含量顯著提高，植酸含量顯著降低的結(jié)果一致。 樊春光（2013）通過復(fù)合菌對豆粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)鈣含量由0.32%提升至0.37%， 總磷含量由0.62%提升至0.68%， 本試驗(yàn)中發(fā)酵雜粕的鈣磷含量分別為0.39%和1.31%，鈣含量與發(fā)酵豆粕相當(dāng)，而總磷含量約為發(fā)酵豆粕的兩倍。 因此發(fā)酵雜粕對日糧中鈣磷的缺乏起到了很好的補(bǔ)充作用， 可減少無機(jī)磷的添加，降低生產(chǎn)成本，同時發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶系及多肽類物質(zhì)還會促進(jìn)機(jī)體對鈣磷的吸收（顧斌等，2011）。

3.2 復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵對雜粕氨基酸組成的影響微生物發(fā)酵可將不易被機(jī)體吸收的大分子物質(zhì)降解為小分子肽、游離氨基酸和低聚糖等，此外發(fā)酵底物中留存有大量消化酶、維生素、氨基酸和未知促生長因子， 從而改善雜粕的營養(yǎng)價值和飼用價值（Dai 等，2017）。 付敏等（2013）利用枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白地霉對菜籽餅進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，游離氨基酸呈線性增加，賴氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的含量分別提高了22.73%、20.39%和 20.51%。 王曉玲等（2016）利用枯草芽孢桿菌ST ～141 和釀酒酵母N5 對棉籽粕進(jìn)行混菌固態(tài)發(fā)酵，48 h 后氨基酸總量和必需氨基酸含量分別增加了22.20%和28.40%。 張夢媛等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，毛霉與魯氏酵母發(fā)酵豆粕后，游離氨基酸含量增加了6.69 倍，總氨基酸含量提高了22.90%，提高了豆粕的營養(yǎng)價值。本試驗(yàn)中，雜粕經(jīng)復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵后，除谷氨酸和精氨酸外，其余氨基酸、總氨基酸、總必需氨基酸含量均不同程度地升高，與前人研究結(jié)果一致。說明雜粕經(jīng)過復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵后，氨基酸組成的含量更高，組成更合理，更有利于在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

3.3 復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵對雜粕霉菌毒素和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響 吳正可等（2018）發(fā)現(xiàn)，混菌固態(tài)發(fā)酵能有效地降低菜籽粕中硫苷的含量， 降解率可達(dá)30.73%；胡永娜等（2012）通過枯草芽孢桿菌、 植物乳桿菌和啤酒酵母三種菌組合對菜籽粕進(jìn)行發(fā)酵，硫代葡萄糖甙、惡唑烷硫酮、單寧、植酸降解率分別為93.44%、99.99%、34.86%、18.15%。王曉玲等（2016）利用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母對棉籽粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，48 h 后游離棉酚的降解率為48.5%。 本試驗(yàn)中，發(fā)酵雜粕中游離棉酚、單寧和植酸的含量分別降低了51.51%、21.21%和23.22%，與上述研究結(jié)果基本一致。 表明復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵能有效降低雜粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子， 對雜粕的營養(yǎng)水平和適口性具有一定的改善作用。

在實(shí)際生產(chǎn)中， 飼料廠和大型養(yǎng)殖場在飼料原料收集和發(fā)酵等方面都是處于開放環(huán)境， 對發(fā)酵條件并沒有嚴(yán)格控制，除了所挑選的菌種，環(huán)境中的能產(chǎn)生霉菌毒素的菌株也可能參與了發(fā)酵過程，威脅生物安全。金佳佳等（2019）以香豆素作為唯一氮源，從豆類發(fā)酵食品、土壤、動物腸道及其內(nèi)容物中篩選出一株具有黃曲霉毒素B1降解能力的菌株，降解率可達(dá)90.70%。 劉盼等（2018）從土壤中篩選出一株具有高效降解玉米赤霉烯酮的枯草芽孢桿菌（L09），經(jīng)過24 h 發(fā)酵后上清液對玉米赤霉烯酮的降解率達(dá)到了96%。 吳娛等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，不同初始質(zhì)量濃度的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇經(jīng)米曲霉 As-W.6 發(fā)酵7 d 后， 降解率均在35%以上。 本試驗(yàn)測定三種常見飼料源霉菌毒素在發(fā)酵前后的變化，發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量降低了21.25%和28.56%，而脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量低于檢出限 （0.2 mg/kg）。 《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 13078-2017）中對黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇給出的限量分別是 30.00 、1000 μg/kg 和 5.00 mg/kg， 雜粕發(fā)酵前后霉菌毒素的含量均低于飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。 由于本試驗(yàn)選取的雜粕 （棉籽粕和菜籽粕）中所含有的霉菌毒素的含量相對較低，發(fā)酵后相應(yīng)的降解率也較低， 但通過復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵對降低以上三種霉菌毒素仍有顯著效果， 可進(jìn)一步保障飼料安全。

3.4 復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵對雜粕酶活性的影響 微生物在生長和發(fā)酵的過程中會分泌大量的酶類，可降解底物中的蛋白質(zhì)、纖維等大分子物質(zhì)，使之更容易被動物吸收利用（張夢媛等，2019）。和小黑（2014）研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵棉籽粕中含有豐富的淀粉酶和蛋白酶。本試驗(yàn)中，發(fā)酵雜粕中蛋白酶和脂肪酶分別提高了115.21%和8.47%， 脂肪酶雖有一定的提高，但差異不顯著。這與廖天江（2018）利用黑曲霉對沙棘籽渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵， 其終產(chǎn)物蛋白酶活性提高705.95%的結(jié)果基本一致。 劉慧菊等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、黑曲霉、植物乳桿菌均能產(chǎn)生一定量的蛋白酶， 其酶活力大小依次為：枯草芽孢桿菌＜黑曲霉＜植物乳桿菌。

4 結(jié)論

通過復(fù)合菌對雜粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵， 有效地降低了抗?fàn)I養(yǎng)因子及霉菌毒素含量， 增加了粗蛋白質(zhì)、鈣、磷的含量，同時雜粕中各氨基酸含量也不同程度的提高， 雜粕的營養(yǎng)價值和飼喂價值得到有效改善。