(王鳳軍 陳 強 葉素丹 許海鋒 宣紅霞 楊伊平 周葉熹

(浙江經貿職業(yè)技術學院，杭州 310012)

《2019年全球生物技術/轉基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢》報告顯示全球轉基因作物商業(yè)化種植面積已達到1.904億公頃[1]。從1996年到2019年，全球轉基因農作物商業(yè)化24年間，種植面積增長了約112倍，全球29個國家/地區(qū)累計種植27億公頃[1]。全球共有71個國家/地區(qū)在食品、飼料和加工方面應用了轉基因作物，已批準4 485項文件，涉及29種轉基因作物的403個轉化體[1]。轉基因玉米在轉基因作物中占有非常重要的地位，種植面積逐年穩(wěn)步上升。截至2019年，全球轉基因玉米的種植面積近6069萬公頃，占轉基因作物總面積的31.87%，占世界玉米總面積的31%左右[1]，當前已經培育出了抗旱、抗蟲、抗除草劑、抗病等多種性狀的共238個轉化體轉基因玉米。目前國外主要種植的轉基因玉米品系有Mon89034、MIR162、Bt11等品系。截至2019年8月，我國批準進口的轉基因玉米轉化體共計21個[3]。

隨著我國農業(yè)轉基因技術研究和農產品貿易的快速發(fā)展，研究、實驗、生產、加工、經營和進口環(huán)節(jié)的農業(yè)轉基因生物種類不斷增多，需強化研究實驗源頭、田間種植和進口加工環(huán)節(jié)監(jiān)管，加強標識管理和科普宣傳，切實履行《種子法》《農業(yè)轉基因生物安全管理條例》《農業(yè)轉基因生物標簽的標識》，保障農業(yè)轉基因生物研究與應用健康發(fā)展，保障公眾知情權和選擇權[4，5]。轉基因技術給人類帶來諸多幫助，但也存在潛在的安全問題，如破壞生態(tài)環(huán)境、引起抗生素耐性、造成基因漂移、引發(fā)食物過敏、隱含對人及動物的潛在毒性等問題[6-9]。國外已批準種植和正在研發(fā)的轉基因品系越來越多，但我國還未頒發(fā)轉基因玉米種子生產許可證，所有轉基因玉米品系均不可在我國進行商業(yè)化種植，僅能用作飼料或加工原料，因此有必要對轉基因玉米品系進行篩查，控制未批準的轉基因玉米品系在市場上的流通。

轉基因成分的篩查檢測及品系快速鑒定主要有蛋白質檢測方法和核酸檢測方法。由于蛋白質檢測方法的局限性，以常規(guī) PCR[10，11]、環(huán)介導等溫擴增[12，13]、實時熒光PCR[14-16]、數(shù)字PCR[18，19]為主的核酸檢測方法逐漸成為主要的檢測手段。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，新型高效的轉基因檢測技術也不斷被研發(fā)出來。如徐君怡等[20]將Taqman微流控芯片技術應用于實時熒光平臺可同時檢測17種轉基因玉米品系，檢出限可達10～20拷貝，符合歐盟轉基因產品檢測方法最低性能要求；Piednoir等[21]利用高通量測序技術對轉基因枯草芽孢桿菌進行測序，通過序列比對設計引物和特異性探針進一步運用qPCR進行確認鑒定；Turkec等[22]設計了轉基因檢測DNA芯片，對轉基因大豆和玉米共設計了1 830個探針，可用于區(qū)分 12個轉基因事件，并開發(fā)了一套數(shù)據算法來實現(xiàn)最大的檢測通量和靈敏度。這些檢測技術雖然通量較高，但檢測技術較為復雜，結果分析需要通過生物信息學算法來實現(xiàn)，實驗過程依賴于昂貴的設備與試劑，較難在日常檢測過程中廣泛應用。急需一種準確高效、簡易可行、高通量的轉基因成分識別和檢測技術，保障食品農產品安全和轉基因產業(yè)良性發(fā)展。

本研究通過靶標基因篩選，轉基因陽性樣品采集，核酸樣本制備，多重引物和熒光探針組合篩選，反應體系優(yōu)化以及方法學驗證等過程開發(fā)建立了四重熒光定量PCR檢測技術。該技術的使用可實現(xiàn)一個反應管中同時檢測MIR162、Bt11、Mon89034三個玉米品系的特異性基因序列和一個玉米內源基因，縮短檢測時限，節(jié)約試劑耗材成本，操作簡單易行，滿足高通量特征，為市場流通產品品系和轉基因成分的實時監(jiān)管和快速鑒定提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

10%MIR162、10%Mon89034、10%Bt11、10%Mon810、100%Mon863、10%NK603、100%Bt176等轉基因玉米標準品；CNAS T025-24/30、CNAS T0659-23/74/79/104/175、ACAS-T067-J273/J213，F(xiàn)APAS GeMSU 56A/56B均為中國合格評定國家認可委員會(CNAS)/英國食品與環(huán)境研究院(FAPAS)能力驗證樣品；玉米陰性樣本為“晶甜3號”“中農甜488(ZNT488)”“金甜玉808”“泰甜8號”“華珍”“珍甜6號”“金甜60”“珍早18”“甜糯3號”“加甜糯11號”。玉米深加工產品為本實驗室2020年市售產品，共41個批次。

1.2 試劑

植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(DP305)、深加工食品DNA提取試劑盒(DP326)、QuantiFast Multiplex PCR Master Mix (204754)、探針與引物(Taqman)：委托機構合成。

1.3 方法

1.3.1 樣本核酸提取

將玉米種子和果實等未加工樣本采用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)提取基因組DNA。玉米深加工制品采用深加工食品DNA提取試劑盒(DP326)提取基因組DNA，其中，裂解、分離、洗滌等過程按照試劑盒說明書操作，在DNA洗脫時，為增加基因組DNA得率，用50 μL進行洗脫，將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2 min后離心，獲取的DNA溶液置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物和探針設計

通過國際環(huán)境風險評估中心轉基因數(shù)據庫(CERA GM crop database，http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database)和加拿大轉基因產品庫(http://www.agbios.com/dbase.php)收集得到目前已公開報道的商品化生產的轉基因玉米品系信息，分析國外流通的常見品系以及我國批準應用和重點監(jiān)控的轉化體信息，選定MIR162、Mon89034、Bt11轉基因玉米為檢測靶標，選定玉米內源基因編碼玉米淀粉合成酶異構體zSTSII-2(zSSIIb)作為體系質控物，通過NCBI和國內外專利檢索得到三種玉米品系的特異性序列。采用 Vector NTI 11. 5 軟件和Express 3.0軟件在在其外源插入片段 3′端與玉米基因組的連接區(qū)序列上設計特異性引物和探針，并在NCBI Blast中進行產物特異性驗證。探針熒光基團按照設備性能進行選擇性標記，淬滅基團按照報告基團偏好確定。

1.3.3 轉基因玉米品系多重熒光PCR方法建立

1.3.3.1 轉基因玉米品系單轉化體特異性驗證

提取轉基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11以及非轉基因玉米ZNT488基因組DNA，加入1.3.2設計的引物探針，采用GB/T 19295.5—2018《轉基因產品檢測 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測方法》[23]標準中反應體系和參數(shù)進行單重實時熒光PCR擴增，設置陽性對照、陰性對照和空白對照，對擴增曲線進行分析，驗證單個轉化體引物探針設計的特異性。

1.3.3.2 轉基因玉米品系多重熒光PCR反應條件優(yōu)化

提取的MIR162、Mon89034、Bt11玉米基因組DNA，按照1∶1∶1進行混合，得到3個品系的混合DNA溶液，以此作為模板，使用引物和探針對進行多重實時熒光PCR擴增，以玉米內源基因zSSIIb擴增情況監(jiān)控反應的有效性。通過單個轉化體的退火溫度梯度(52～64 ℃)確定各靶標基因的最佳退火溫度區(qū)間，然后在共有區(qū)間范圍內設置溫度梯度，確定四重實時熒光PCR的最佳退火溫度。以此退火溫度，通過上下游引物和探針濃度十字交叉法(0.1～1.5 μL)確定4個靶標基因的引物探針的最佳濃度組合，最終確認多重熒光PCR反應體系和參數(shù)。擴增反應在ABI QuantStudio Q5實時熒光PCR儀中進行，實驗設置3個平行重復，以MIR162、Mon89034、Bt11轉基因玉米標準品的混合DNA為陽性對照，以非轉基因玉米ZNT488為陰性對照，并設置非模板空白對照，以驗證4個靶標基因之間有無信號干擾以及實驗操作過程是否被污染。

1.3.4 轉基因玉米品系多重實時熒光PCR特異性檢測

提取轉基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11、NK603、T25、Bt176、Mon863、Mon810以及非轉基因玉米ZNT488基因組DNA，對已知單組分DNA或多組分DNA使用多重熒光定量PCR體系進行多重檢測，驗證反應體系的特異性。

1.3.5 靈敏度檢測

提取轉基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11樣本基因組DNA，并按1∶1∶1比例混合作為DNA模板原液，將其進行10倍系列稀釋，共稀釋5個梯度，稀釋介質為滅菌蒸餾水。根據玉米的單倍體基因組DNA長度為2 504 bp，混合樣本經核酸蛋白分析儀測定濃度為20 ng/μL，按照式(1)計算玉米樣品中的拷貝數(shù)[23]。將稀釋后的DNA溶液為模板進行四重實時熒光PCR擴增，對擴增得到的Ct值和DNA模板拷貝數(shù)繪制標準曲線，計算4個檢測靶標的擴增效率和檢測低限。

(1)

式中：N為DNA拷貝數(shù)；ContDNA為DNA量/ng；LenDNA為基因組DNA長度/bp。

1.3.6 適用性檢測

收集玉米種子，玉米深加工食品，轉基因玉米標準品以及能力驗證盲樣等用品，其中包括實驗室收集的轉基因玉米標準品6種(Mon89034、MIR162、Bt11、MON863、MON810、NK603)及其混合DNA樣本5種，中國合格評定國家認可委員會(CNAS)組織的能力驗證樣品(T067-J273)，英國FAPAS分析實驗室組織的能力驗證樣品(GeMSU56A和GeMSU568)；來自不同農作物種子市場和互聯(lián)網農作物銷售商等10個玉米品系種子樣本(晶甜3號、ZNT488、金甜玉808、泰甜8號、華珍、珍甜6號、金甜60、珍早18、甜糯3號、加甜糯11號)，作為可種植的農作物活生物體代表。來自于農貿市場和超市的41份玉米食品，即罐裝玉米(11批次)、玉米粉(20批次)、爆米花(10批次)。應用四重實時熒光PCR對這64份玉米及其深加工制品進行轉基因品系及轉化體成分進行檢測分析。

2 結果與分析

2.1 樣品核酸提取結果

提取的DNA溶液經0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰明亮，完整性好。經核酸蛋白分析儀檢測，OD260/280大于1.5表明核酸純度較高，蛋白質殘留較少；OD260/230大于1.0，表明有機試劑和多糖的污染較低，提取的核酸較純。結果表明提取效果良好，可用于實時熒光PCR檢測。

2.2 引物和探針標記和篩選結果

針對轉基因玉米內源基因zSSIIb和轉基因玉米MIR162、Mon89034和Bt11轉化體目標序列設計特異性引物和探針，為能在1個反應管中同時檢測4個靶標，按照設備性能使用不同的報告基團和非熒光淬滅基團進行標記。將以上引物和探針采用GB/T 19295.5—2018《基因產品檢測 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測方法》標準中反應體系和參數(shù)分別對轉基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11以及非轉基因玉米ZNT488基因組DNA進行單重實時熒光PCR擴增，得到單轉化體的擴增結果與預期結果一致。篩選出用于多重熒光PCR的引物和探針序列見表1。

表1 轉基因玉米品系特異性檢測的引物和探針序列

2.3 多重熒光PCR反應條件優(yōu)化結果

為了能夠在同一反應管中檢測4個靶標基因，并保持較高的反應效率，需對反應體系和條件進行優(yōu)化。由于使用了商用化的多重熒光定量PCR預混液，主要優(yōu)化的參數(shù)有退火溫度、引物和探針濃度等。通過對MIR162、Mon89034、Bt11單一轉化體以及內源基因zSSIIb分別設置退火溫度梯度，進行單重實時熒光PCR反應，發(fā)現(xiàn)當退火溫度太低時Ct出現(xiàn)的較晚，影響結果的靈敏度；當退火溫度較高時無明顯的指數(shù)型生長曲線。以MON89034為例，見圖1，結果表明在56～58 ℃時3個轉化體和內源基因均能有較好的擴增，且在該溫度區(qū)間設置梯度進行四重實時熒光PCR反應，發(fā)現(xiàn)最佳退火溫度為58 ℃。

圖1 mon89034退火溫度梯度單重熒光PCR擴增曲線圖

通過十字交叉法和熒光標記的強弱與熒光信號之間的關系進行了引物和探針濃度優(yōu)化，最終確定了最佳引物和探針濃度。優(yōu)化后的擴增體系見表2。優(yōu)化后的擴增參數(shù)為95 ℃預變性5 s；95℃變性15 s，58 ℃退火延伸1 min，變性和退火延伸共進行40個循環(huán)。

表2 轉基因玉米品系的四重實時熒光PCR反應混合液組成

2.4 多重熒光PCR特異性檢測結果

提取轉基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11、NK603、T25、Bt176、Mon863、Mon810以及非轉基因玉米ZNT488基因組DNA，使用多重熒光定量PCR體系進行轉基因品系鑒定，驗證方法的特異性。圖2分別為轉基因玉米MIR162/Mon89034/Bt11混合樣本、轉基因玉米MIR162、轉基因玉米Mon89034、轉基因玉米Bt11、轉基因玉米Mon863/NK603/T25/Bt176混合樣本以及非轉基因玉米ZNT488多重實時熒光PCR擴增反應結果。內源基因zSSIIb均產生了明顯的S型擴增曲線，Ct值小于35，表明DNA提取過程和實時熒光PCR擴增有效。轉基因玉米MIR162/Mon89034/Bt11混合樣本為模板的反應管中轉基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11三個品系的轉化體特異性基因序列均檢出，表明樣品中含有這三種玉米品系的轉化體成分；在圖2b～圖2d中轉化體特異性靶標基因僅在含有該基因的轉化體玉米品系為模板的反應管中檢出，非該轉化體玉米品系不檢出；在圖2e～圖2f中，Mon863/NK603/T25/Bt176混合樣本和非轉基因玉米ZNT488為模板的反應管中都僅有玉米內源基因zSSIIb檢出，3種玉米品系的轉化體特異性基因均未檢出，表明這些樣品中不含有這3種玉米品系的轉化體成分。

注：a為轉基因玉米MIR162/Mon89034/Bt11混合樣本；b為轉基因玉米MIR162；c為轉基因玉米Mon89034；d為轉基因玉米Bt11；e為轉基因玉米Mon863/NK603/T25/Bt176混合樣本；f為非轉基因玉米ZNT488。

以滅菌蒸餾水為模板的空白對照管中無熒光信號，表明檢測基因之間無信號干擾，多重實時熒光PCR的反應結果與期望結果一致，表明引物探針的設計及反應體系的設置具有特異性，可用于玉米轉基因品系及其轉化體成分的快速鑒定。

2.5 多重熒光PCR重復性和靈敏度檢測

通過建立轉基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11混合DNA溶液梯度稀釋后四重實時熒光PCR的標準曲線，分析擴增的Ct值。四個基因相關系數(shù)R2為0.995～0.998。同一基因同一稀釋梯度范圍內Ct值的變異系數(shù)較小，重復性較好，如圖3所示。zSSIIb基因線性回歸方程為y=-3.152x+35.746，Ct值變化范圍在22.366～35.324之間，標準偏差0.037～0.305，R2為0.996，擴增效率為107%；MIR162轉化體特異性基因線性回歸方程為y=-3.295x+37.677，Ct值變化范圍在23.763～37.680，標準偏差在0.084～0.647，R2為0.998，擴增效率為101%；Mon89034轉化體特異性基因線性回歸方程為y=-3.458x+39.236，Ct值變化范圍在24.701～38.912，標準偏差在0.160～0.876，R2為0.996，擴增效率為94.6%；Bt11轉化體特異性基因線性回歸方程為y=-3.266x+39.510，Ct值變化范圍25.844～38.990，標準偏差在0.054～0.366，R2為0.997，擴增效率為102%，表明該四重實時熒光PCR擴增體系穩(wěn)定靈敏，最低檢測限可達18個拷貝。

2.6 樣品檢測結果

對市場流通的41份玉米加工食品樣品，6種轉基因標準品及其5種標準品混合樣本，不同農作物種子市場和互聯(lián)網農作物銷售市場流通的10份農作物活生物體種子樣本，3份非玉米成分樣本，以及3份能力驗證盲樣樣本等68份分樣品進行轉基因品系及轉化體成分進行檢測分析。同時按照GB/T 19295.5—2018《轉基因產品檢測 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測方法》中所述的引物和探針、檢測步驟和反應程序對樣品進行檢測[23]，結果見表3。使用本研究建立的四重實時熒光PCR方法檢測實驗室收集的轉基因標準品、能力驗證盲樣和陽性樣本，檢測結果與樣本信息一致。使用四重實時熒光PCR檢測10個玉米種子樣本和41份玉米及其深加工制品樣本結果與單重實時熒光PCR檢測結果一致，只有內源基因zSSIIb檢出，均為陰性結果。使用四重實時熒光PCR檢測檢測非玉米成分產品，4個靶標基因均無信號。表明本實驗研究開發(fā)的四重實時熒光PCR快速品系鑒定體系適用于玉米轉基因品系及其轉化體成分的快速鑒定，尤其是大量樣本的快速檢測。

表3 四重熒光定量PCR適用性檢測結果

3 討論

轉基因生物技術商業(yè)化在不斷加速推進，但目前我國被批準進行商業(yè)化種植的轉基因作物僅有棉花和木瓜，批準進口轉基因品種包括大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜等，但進口的轉基因品種只能用作加工原料，不允許在國內種植。轉基因產品合規(guī)性監(jiān)控和檢測方法種類繁多，其中蛋白質免疫印跡法實驗過程復雜，耗時較長(通常在5 h以上)，檢測通量小，使用試劑復雜；酶聯(lián)免疫吸附法靈敏度較PCR方法低，當外源基因表達的蛋白質含量極低時，難以檢測出來；膠體金免疫層析法雖操作簡便、耗時短，但檢測靈敏度偏低，經過加工的轉基因食品中靶蛋白質結構改變，不能被抗體識別。環(huán)介導等溫擴增技術成本低廉，適合大規(guī)模篩查，但其對靶序列存在一定的限制，假陽性問題較為嚴重，易受到實驗室氣溶膠的污染容易產生非特異性擴增；基因芯片技術對于轉基因食用農產品的檢測，從實驗成本考慮，價格過于昂貴，不適宜普遍推廣應用。為提高轉基因檢測的準確性和時效性，急需開發(fā)建立能同時多基因檢測且能避免常規(guī)PCR法缺陷的新方法。

多重熒光定量PCR方法兼具了熒光PCR實時定量與多重反應高通量的特征，是大批量樣本篩查檢測和快速鑒定的金標準。現(xiàn)已研發(fā)出可同時對番茄、大豆、玉米等農作物轉基因成分進行篩查檢測的四重實時熒光PCR，在品系鑒定方面研究應用較少。本研究通過檢索國內外轉基因數(shù)據庫，從國內轉基因監(jiān)控較為關注的轉基因玉米品系中確定檢測靶標，建立多重熒光PCR檢測技術。通過檢測質控，方法學驗證等確保檢測準確性和可靠性。

4 結論

本研究利用實時熒光PCR法，根據多重熒光定量PCR反應中的特異性S曲線與對應的閾值大小判斷被檢樣品中是否含有MON89034、MIR162、Bt11轉基因玉米品系及其轉化體成分。該檢測方法設置了核酸提取質控、陽性對照、陰性對照和空白對照，可同時檢測玉米內源基因和3個玉米品系的特異性靶標基因，擴增效率均在90%～110%范圍內，最低檢測限為18個拷貝。該方法可實現(xiàn)在一個反應孔中同時檢測四個無熒光信號干擾的靶標基因，操作簡單易行，從DNA提取到報告結果耗時不足 3 h，適用于大量樣品的高通量檢測，可為轉基因玉米品系的快速鑒定和篩查提供參考。