(陳鑫璐 邱 月 張建友 丁玉庭 呂 飛

(浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，杭州 310014)

1 谷物真菌毒素概述

1.1 真菌毒素

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物[1]，對肝臟、腎臟、造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)有嚴(yán)重的毒性，同時還有致癌、致突變、致畸等作用[2，3]。目前已發(fā)現(xiàn)了近400種真菌毒素[4]，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)估計每年有高達25% 的糧食受到真菌毒素的污染，而實際真菌毒素污染發(fā)生率(60%～80%)遠高于25%[5，6]。

1.2 谷物中常見真菌毒素

谷物是真菌毒素的主要污染對象之一，谷物中常見的真菌毒素包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌毒素、嘔吐毒素、T-2毒素、HT-2毒素和玉米赤霉烯酮等[2]，其毒性作用主要有致癌、致畸、損害肝腎功能，還具有細胞毒性和胚胎毒性，也會導(dǎo)致皮下出血與皮膚壞死、雌激素綜合癥等[7]。

1.3 谷物中多種毒素共存情況

谷物在種植、收獲、運輸及儲藏過程中都可能遭受產(chǎn)毒真菌污染，受到污染谷物往往同時含有多種真菌毒素，并易產(chǎn)生復(fù)雜的毒性作用[4]。多種真菌毒素共存通常會產(chǎn)生協(xié)同毒性增強效應(yīng)。有研究證實，低于國家食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、ZEN和黃曲霉毒素B1(AFB1)共存時能造成細胞代謝的嚴(yán)重紊亂[8]。黃曲霉毒素G1(AFG1)、伏馬菌素B1(FB1)、OTA以及雜色曲霉毒素(ST)也被發(fā)現(xiàn)具有聯(lián)合肝細胞毒性，其中OTA 與 FB1之間存在中度協(xié)同作用[9]。Sobral等[10]研究證實，OTA-DON和AFB1-DON組合對肝、腸上皮細胞均有協(xié)同毒性作用。除此之外，OTA和FB1也被證實對肝、腎細胞系中具有協(xié)同毒性效應(yīng)[11]。動物體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)了類似的毒素間協(xié)同效應(yīng)導(dǎo)致毒性增強的現(xiàn)象，如FB1和AFB1共存時會產(chǎn)生協(xié)同肝、腎毒性與致癌作用[12]。真菌毒素種類繁多，其在谷物中的共存情況受到谷物種類、產(chǎn)區(qū)、氣候等多種條件的影響，相關(guān)規(guī)律尚不明確；另一方面，對于多種毒素的協(xié)同毒性作用，迄今為止仍缺乏系統(tǒng)、有效的評估策略，因此，世界各國尚未對多種毒素共存問題作出明確規(guī)定。但大量數(shù)據(jù)表明，毒素間的協(xié)同毒性增強效應(yīng)會在低于單一毒素限量標(biāo)準(zhǔn)的劑量下對人和動物的健康造成較大威脅，因而必須引起重視。

除不同種類毒素的協(xié)同毒性效應(yīng)外，一些真菌毒素本身具有多種對健康有負面影響的衍生物。研究表明，在某些情況下DON的乙?；苌?A-DON和15A-DON的毒性作用甚至高于其本體[13]，乙?；腄ON在生物體內(nèi)可全部或部分水解以釋放母體糖苷配基轉(zhuǎn)化成DON，潛在地増加了DON攝入量[14]。ZEN及其代謝產(chǎn)物ZOL也被證明均具有雌激素效應(yīng)，α-ZOL的效應(yīng)強度約為ZEN及β-ZOL的2～4倍[15]。因此，高效準(zhǔn)確的多類型真菌毒素同步檢測技術(shù)的開發(fā)對準(zhǔn)確分析谷物的真菌毒素的污染情況，降低由此引發(fā)的食品安全風(fēng)險具有重要意義[3]。

2 谷物中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)和檢測標(biāo)準(zhǔn)

2.1 限量標(biāo)準(zhǔn)

由于真菌毒素對人與動物健康的潛在威脅，各國和地區(qū)對谷物中諸多真菌毒素均建立了嚴(yán)格的限量規(guī)定，尤其是一些毒性較強的種類。不同國家和地區(qū)制定的限量水平參差不齊，限量標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的食品基質(zhì)適用范圍具有較大差異，缺乏相對的統(tǒng)一性。

2.1.1 黃曲霉毒素

如表1所示，AFB1是目前已發(fā)現(xiàn)的毒性最強的黃曲霉毒素，我國針對不同谷物中AFB1的最高允許量進行了嚴(yán)格的分類規(guī)定。日本規(guī)定食品中的黃曲霉毒素限量為10 μg/kg。美國規(guī)定一般食品中黃曲霉毒素含量不得超過15 μg/kg。歐盟對谷物和谷物制品中黃曲霉毒素的限量有更加細致的分類標(biāo)準(zhǔn)，既對谷物和谷物產(chǎn)品中黃曲霉毒素總量(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)進行了規(guī)定，又特別標(biāo)明了其中AFB1的最高限量標(biāo)準(zhǔn)。

表1 國內(nèi)外主要谷類產(chǎn)品中真菌毒素限量[16-19]

2.1.2 赭曲霉毒素

OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)情況與黃曲霉毒素基本相同，世界范圍內(nèi)的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.5～50 μg/kg。赭曲霉毒素B(OTB)和赭曲霉毒素C(OTC)毒性較OTA小，在谷物中并不常見，目前尚未制定關(guān)于OTB和OTC的限量標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.3 單端孢霉烯族毒素和伏馬毒素

對于DON大多數(shù)國家都有嚴(yán)格的限量規(guī)定，但對T-2、HT-2和伏馬菌毒素制定限量標(biāo)準(zhǔn)的國家則較少，我國在2008年發(fā)布過配合飼料中T-2的允許量(GB 21693—2008)，但現(xiàn)已廢止，也未有新的限量標(biāo)準(zhǔn)替代；我國對HT-2和伏馬菌毒素的限量也沒有明確規(guī)定。

2.1.4 玉米赤霉烯酮

我國國標(biāo)規(guī)定小麥和玉米中ZEN的限量為60 μg/kg，歐盟對其限量有嚴(yán)格規(guī)定，國際上對于該毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)范圍在20～350 μg/kg之間。日本、美國和CAC對玉米赤霉烯酮的限量沒有明確規(guī)定。

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 檢測標(biāo)準(zhǔn)

對比國內(nèi)外食品真菌毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)(表2)，歐盟的谷物真菌毒素檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)展較早，大多采用免疫親和柱凈化或固相萃取等前處理手段，聯(lián)合高效液相色譜法檢測。HPLC具有較高的可靠性，但對于性質(zhì)相近的物質(zhì)難以有效分離，需要一定的前處理步驟來保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。免疫親和柱操作簡單、分析快速、精密度高，可以獲得純凈的樣品提取物，同時避免了大量有機試劑的使用，但缺點是價格昂貴大大提高了檢測成本。固相萃取效率高，溶劑用量少，但不具備免疫親和柱的特異性，因而可能因樣品凈化不徹底影響后續(xù)檢測。此外，一些標(biāo)準(zhǔn)在樣品前處理中使用了衍生化方法以調(diào)整待測毒素的色譜性質(zhì)，從而提高檢測準(zhǔn)確性，但衍生化步驟繁瑣，衍生不完全時會對檢測結(jié)果造成較大影響。我國在2016年頒布了一系列谷物中真菌毒素檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)。與歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(European Committee for Standardization, CEN)和國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization，ISO)體系相比，我國真菌毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)中所涉及的樣品種類更多。在毒素種類上，我國現(xiàn)已制定了T-2毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)(SN/T 3136—2012)，這在國外真菌毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)中尚未出現(xiàn)。檢測技術(shù)上，我國率先規(guī)范了使用LC-MS同步檢測食品中多種真菌毒素的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T 3136—2012)，還涉及LC-MS與同位素稀釋相結(jié)合的檢測方法。液質(zhì)聯(lián)用對樣品前處理的要求相對較低，且相比單純使用液相色譜檢測具有更高的可靠性和檢測靈敏度，是目前多種毒素同步檢測最為有效的方法，但缺點是設(shè)備昂貴，且對操作人員技術(shù)要求較高。同位素稀釋法只需對復(fù)雜混合物體系進行部分分離、純化就可對物質(zhì)進行定量和定性檢測，但是操作繁瑣，對實驗結(jié)果處理也更耗時。

表2 中國與歐盟現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中多種真菌毒素在谷物中的檢測方法[19-25]

此外，在我國的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、進出口標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)中，谷物中多種真菌毒素的同步檢測技術(shù)也有涉及。在SN/T 3136—2012中，將LC-MS/MS作為花生、谷類及其制品中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素的同步檢測方法；在DB34/T 2776—2016中，采用LC-MS分兩步對谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素(DON、15A-DON、3A-DON)、黃曲霉素(B1、B2、G1、G2)、伏馬毒素(FB1、FB2)和ZEN進行測定，但上述檢測標(biāo)準(zhǔn)只有檢測限。在LS/T 6133—2018中，利用LC-MS同步檢測谷物中的16種真菌毒素，并能對16種真菌毒素進行定量檢測。但是以上三個標(biāo)準(zhǔn)無法滿足歐盟真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)中嬰幼兒食品不得檢出AFT和OTA低于0.5 μg/kg的限量要求。因此，建立高靈敏度、高通量的真菌毒素同步檢測方法至今仍是食品安全領(lǐng)域的一項重大挑戰(zhàn)，亟需進一步發(fā)展和規(guī)范化。

3 多種真菌毒素同步檢測方法

近年來，多種毒素同步檢測技術(shù)的發(fā)展相對較為迅速。論文綜述了真菌毒素同步檢測方法，主要包括ELISA、免疫層析、分子技術(shù)、生物傳感、高效液相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附法是將已知的抗原或抗體固定于固相載體表面，使酶標(biāo)抗原或抗體與之發(fā)生特異性結(jié)合[26]。目前根據(jù)ELISA技術(shù)開發(fā)的商業(yè)化的真菌毒素檢測試劑盒已在市場上廣泛推廣，Dong等[27]基于酶聯(lián)免疫吸附，開發(fā)了一種能同步檢測ZEN及其5種主要類似物的方法。不同基質(zhì)樣品ZEN及其主要類似物檢測限和定量限分別為114.2～812.3 ng/L和237.1～1 653.9 ng/L。Arola等[28]采用ELISA對小麥、大麥和燕麥中的T-2和HT-2毒素進行同步檢測，相應(yīng)的檢測限分別為0.3、0.1、0.3 ng/mL。ELISA法操作簡便、特異性強、靈敏度高，適合大量樣品的快速篩選，但其測定結(jié)果易出現(xiàn)假陽性問題。同時，ELISA法采用酶蛋白作為標(biāo)記物，需要進行復(fù)雜的前處理消除樣品中物質(zhì)的干擾[29]。

3.2 免疫層析技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是一種以膠體金作為抗原或抗體的示蹤劑標(biāo)記物的可視化免疫檢測技術(shù)[26]。基于免疫膠體金技術(shù)開發(fā)的商業(yè)化的真菌毒素檢測試劑盒已在市場上得到初步應(yīng)用，李鑫[30]建立了可同時檢測黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮三種真菌毒素的免疫膠體金技術(shù)，可視化檢測限分別為0.25、0.5、1 ng/mL。Duan等[31]采用膠體金技術(shù)，在10 min內(nèi)可完成玉米中OTA、FB1和ZEN的同步檢測，可視化檢測限分別為5、20、10 ng/mL。免疫膠體金技術(shù)在多種真菌毒素檢測上雖然具有操作簡便、快速，可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)勢，且近年來隨著技術(shù)的進步檢測靈敏度也得到了較大改善，但膠體金作為標(biāo)記材料存在成本高、易受環(huán)境干擾、易受樣品基質(zhì)干擾等問題，同時由于試紙條制備時易出現(xiàn)不均勻現(xiàn)象以及非特異性吸附都會導(dǎo)致檢測結(jié)果產(chǎn)生較大誤差[29]。

3.3 分子技術(shù)

3.3.1 多重聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Multiplex PCR)

多重PCR技術(shù)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對以上的引物，同時擴增出多個核酸片段，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與僅使用一對引物的普通PCR相同。Priyanka等[32]基于多重引物PCR技術(shù)以及黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮和延胡索霉素的產(chǎn)毒基因建立了一種快速、經(jīng)濟、簡便，能同時檢測這5種毒素產(chǎn)生菌的方法，可用于預(yù)測谷物中這幾種主要真菌毒素的污染情況。Nwachukw等[33]基于聚合酶鏈反應(yīng)條件下擴增的黃曲霉、赭曲霉和青霉的產(chǎn)毒基因，篩選市場上銷售的棕櫚油樣品中的黃曲霉毒素基因和赭曲霉毒素基因，對食品加工過程中產(chǎn)生真菌毒素的真菌進行監(jiān)測。多重PCR雖然有著廣泛的應(yīng)用前景，但是存在一些弊端。它本質(zhì)上檢測的是某一段產(chǎn)毒基因，而毒素產(chǎn)生涉及復(fù)雜的代謝過程，往往會受到諸多環(huán)境因素的影響，部分非產(chǎn)毒菌株有時也會攜帶一段產(chǎn)毒基因，因而檢測到某一段目標(biāo)產(chǎn)毒基因并不代表一定存在毒素污染，即使用多重PCR進行毒素污染的預(yù)測極有可能得到假陽性結(jié)果。此外，多重PCR擴增效率的一致性是最大的難題，擴增子越多，不均一性越高，檢測的準(zhǔn)確性相對也越難以保證。另一方面，如何降低檢測成本也是未來完善多重PCR真菌毒素檢測技術(shù)需要考慮的問題。

3.3.2 熒光原位雜交(FISH)

熒光原位雜交是以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的非放射性原位雜交方法。許琳[34]利用不同顏色的微球標(biāo)記單克隆抗體建立了真菌毒素混合污染多色免疫層析同步檢測技術(shù)，實現(xiàn)黃曲霉毒素B1、T-2和玉米赤霉烯酮混合污染的同步檢測，其可視檢測限分別為1.6、64.2、6.3 nmol/L。歐陽歲燕[35]以量子點納米球為熒光標(biāo)記材料，分別制備3種真菌毒素的抗體熒光探針，建立了能同步檢測AFB1、ZEN、FB1的量子點納米球免疫層析檢測技術(shù)。在甲醇溶液、玉米基質(zhì)、花生基質(zhì)中,該方法對AFB1、ZEN、FB1的檢測限分別為2.4、2.5、4.5 ng/kg，20.4、28.1、36.3 ng/kg，2.5、3.2、4.0 ng/kg，檢測線性范圍均可達兩個數(shù)量級。但這項研究只是從原理上說明了這項技術(shù)能對真菌毒素等小分子量毒素進行多重分析，對于后續(xù)實際應(yīng)用還有一段路要走。

3.4 生物傳感

生物傳感器是以生物質(zhì)敏感材料(包括抗體、酶、核酸、微生物、細胞、組織等)為識別元件，結(jié)合能將化學(xué)信息轉(zhuǎn)化為光、電、聲等可測量信號的信號元件組成的檢測分析系統(tǒng)[36]，由于具有高通量、高靈敏度和選擇性，操作簡單，可實現(xiàn)快速檢測等優(yōu)點，已被廣泛用于真菌毒素同步檢測。Wang等[37]開發(fā)了一種能同時檢測OTA和FB1的電化學(xué)磁控適配體傳感器，該法對OTA和FB1的檢測范圍分別為10pg/mL～10 ng/mL和 50 pg/mL～50 ng/mL，并成功應(yīng)用于玉米樣品。Nolan等[38]利用質(zhì)量敏感微陣列(MSMA)同步、半定量檢測T-2毒素、ZEN和FB1，靈敏度分別為6.1、3.6、2.4 ng/mL。生物化學(xué)傳感器雖然快速便捷，但是技術(shù)仍不成熟，在檢測范圍、靈敏度、抗干擾能力、重現(xiàn)性、造價和重復(fù)使用率等方面還存在不足，需要進一步研究。

3.5 HPLC

高效液相色譜法由于檢測結(jié)果較為可靠，且成本和對操作人員的技術(shù)水平要求與質(zhì)譜聯(lián)用相比都相對較低，因而仍是目前甚至未來很長一段時間實驗室廣泛采用的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)分析方法。Marcin等[39]采用HPLC-UV對波蘭市場上100個啤酒樣品中的毒素進行了同步測定，DON、NIV和DON-3G(deoxynivalenol-3-glucoside)的發(fā)生率分別為56%、83%和67%。Ozgur等[40]采用HPLC-UV和HPLC-FLD對谷物及其制品中的DON和ZEA進行了同步測定，定量限分別為46.90～72.30 μg/kg和3.50～3.70 μg/kg。但HPLC對真菌毒素的定性與定量都需要標(biāo)準(zhǔn)品；在實際實驗環(huán)境下，真菌毒素的保留時間會隨著環(huán)境等因素的變化而產(chǎn)生偏移；對于多種毒素的測定，前處理操作復(fù)雜，液相條件的摸索與方法建立較為耗時，極性相近的物質(zhì)很難分離。

3.6 GC/LC-MS

近年來，在有關(guān)真菌毒素檢測的文獻中，色譜-質(zhì)譜(MS)聯(lián)用檢測方法占50%以上[1]。質(zhì)譜檢測的高選擇性在一定程度上簡化了樣品前處理和純化步驟，并能提供毒素分子詳細的結(jié)構(gòu)信息，提高對目標(biāo)物識別的準(zhǔn)確性與靈敏度。國內(nèi)最近的一項研究表明，通過HPLC-MS可實現(xiàn)小麥粉中28種真菌毒素的同步檢測[41]。目前，在大部分真菌毒素檢測研究中，基本采用MS與氣相色譜(GC)或液相色譜(LC)聯(lián)用的方法。GC-MS在測定之前需要對毒素化合物進行衍生化，樣品預(yù)處理較為復(fù)雜。Carrasco等[42]采用GC-MS/MS對182份谷物粉碎樣品中的單端孢霉素、棒曲霉素和玉米赤霉烯酮進行測定，所測真菌毒素的定量限低于10 μg/kg，谷物的回收率在毒素濃度為20 μg/kg和80 μg/kg時，分別為76%～108%和77%～114%，RSD小于9%。

LC-MS則不需要進行衍生化就可對多種毒素同時進行定性和定量檢測，特異性強、靈敏度高、檢出限低，是目前被廣泛采用的真菌毒素同步檢測方法。LC-MS/MS能一次性的定性和定量檢測多種真菌毒素，成為近年來多種真菌毒素同步檢測的主要方法。Elaridi等[43]采用LC-MS/MS同時檢測小麥谷物、小麥面粉和面包中的OTA、OTB、T-2和HT-2毒素，準(zhǔn)確度高達到98%～100%，回收率達到93%～105%。Scarpino等[44]采用高效液相三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ESI-TQ-MS/MS)同時測定玉米和小麥中的真菌毒素，在反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式下，對FB1、FB2、DON、ZEA、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2等17種真菌毒素進行負離子和正離子掃描，選定強度相對大的子離子，以母離子-子離子對對玉米和小麥中的毒素分子進行確證。三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜定量能力好，但是分辨力不足，容易受m/z近似的離子干擾，因而Wang等[37]采用了分辨率更高且對m/z近似離子具有更好的定性區(qū)分度的超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)對玉米中的9種真菌毒素進行了同步檢測，檢測限為0.05～50 μg/kg，定量限為0.1～200 μg/kg。此外，謝剛等[45]基于四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)，建立了同時檢測玉米中16種真菌毒素和11種農(nóng)藥殘留的方法。該法直接使用目標(biāo)物母離子的精確分子質(zhì)量進行定量分析，不需要對目標(biāo)物子離子進行逐個優(yōu)化，大大簡化了分析方法建立的難度。靜電場軌道阱質(zhì)譜對目標(biāo)物跟未知物質(zhì)有更高的確證能力，能有效預(yù)防假陰性、能分辨出質(zhì)量數(shù)差別極小的離子，并且能同時篩查大量分析物[46]。與TOF相比，靜電場軌道阱質(zhì)譜在大大提高分辨率的同時，也具備出色的定量能力。液質(zhì)聯(lián)用在檢測靈敏度和準(zhǔn)確度上有著極大的優(yōu)勢，但檢測成本較高，開發(fā)低成本、快速、操作簡便的檢測技術(shù)，并應(yīng)用于現(xiàn)場同步檢測真菌毒素是未來液質(zhì)聯(lián)用法的研究熱點[47]。

4 總結(jié)與展望

由于谷物真菌毒素污染的頻發(fā)性及其對人與動物健康造成的威脅，國內(nèi)外已針對這一問題制定了一系列安全限量與檢測標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在兩個突出的問題：一是目前世界各國現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)體系對毒素及谷物種類劃分不夠細致，且缺乏統(tǒng)一性；二是受到毒理學(xué)研究與檢測技術(shù)發(fā)展限制，仍有許多已被證實具有安全隱患的真菌毒素尚未被納入標(biāo)準(zhǔn)體系，且目前的安全限量與檢測標(biāo)準(zhǔn)基本未考慮多種真菌毒素共存這一極為普遍的情況。谷物真菌毒素污染的監(jiān)管離不開有效的檢測手段，對于多種毒素同步檢測，盡管技術(shù)上已經(jīng)有了較大的突破，但現(xiàn)有方法在檢測準(zhǔn)確性、成本和可操作性方面仍有待完善，開發(fā)高通量、快速、穩(wěn)定、低成本的多種毒素同步檢測技術(shù)依然是食品安全領(lǐng)域面臨的一項挑戰(zhàn)。另一方面，進一步推進真菌毒素毒理學(xué)研究，尤其是建立多種毒素共存時協(xié)同毒性效應(yīng)的有效評估策略，對于更為合理的安全限量標(biāo)準(zhǔn)的制定也具有重大意義。