吳治明 陰 琪 田 野 褚宏亮**

(1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009；2.南京醫(yī)科大學(xué)，南京 211166)

三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus是我國流行性乙型腦炎(Japanese B encephalitis，乙腦)的主要傳播媒介，其孳生地多為稻田，廣泛接觸農(nóng)業(yè)用殺蟲劑，由于殺蟲劑的連續(xù)大量使用，導(dǎo)致了三帶喙庫蚊抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。目前，我國很多地區(qū)三帶喙庫蚊幼蟲已經(jīng)對多種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性(周明浩等，2006；劉洪霞等，2008；王軍浩等，2010；孫養(yǎng)信等，2011；楊維芳等，2011；吳治明等，2013；蔡蓉等，2015；楊迎宇等，2016)。其中江蘇、廣東、海南、陜西、安徽、湖南等6個省份12個自然種群三帶喙庫蚊幼蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性倍數(shù)在1.70～103.93之間，對殘殺威的抗藥性倍數(shù)在51.32～108.83之間，對敵敵畏抗性倍數(shù)在291.85～530.89之間；山東省濟南市歷城區(qū)三帶喙庫蚊幼蟲對雙硫磷的相對抗性倍數(shù)則高達7977.8倍。

表1 5個三帶喙庫蚊種群采集點信息Tab.1 Origins of five populations of Cx. tritaeniorhynchus

蚊蟲抗藥性監(jiān)測是了解其抗藥性發(fā)生發(fā)展的重要手段，監(jiān)測結(jié)果為殺蟲劑的合理使用和蚊蟲的科學(xué)防制提供數(shù)據(jù)支撐。在我國蚊蟲抗藥性的常規(guī)監(jiān)測中，生物學(xué)測定方法被廣泛推薦使用，具有結(jié)果直觀、方法容易掌握等優(yōu)點，但也存在諸如檢測結(jié)果重復(fù)性較差、影響檢測結(jié)果的因素較多、所需實驗蚊蟲數(shù)量多、試驗蚊蟲飼養(yǎng)困難和生測過程工作強度大等缺點。因此，測試評價更加便捷實用的方法對于蚊蟲抗藥性常規(guī)監(jiān)測極為必要。此外，隨著對蚊蟲抗藥性分子機制的深入研究，已證實可以通過檢測蚊蟲抗藥性靶標基因頻率的方法來反映其對相關(guān)殺蟲劑的抗性水平(Wuetal., 2016)，且該方法具有監(jiān)測結(jié)果準確、操作簡單、蚊蟲數(shù)量需求少等優(yōu)點。

本研究采集了我國東南沿海4個省份的5個自然種群三帶喙庫蚊成蚊，采用美國CDC生測瓶法(CDC，2010)測定其對2種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的敏感性，并采用分子生物學(xué)方法檢測其與擊倒抗性(Knockdown resistance，kdr)相關(guān)的鈉離子通道等位基因頻率。以期了解我國東南沿海三帶喙庫蚊抗藥性水平，從而為三帶喙庫蚊的科學(xué)防制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲采集

2019年4—9月，在我國東南沿海的海南、福建、浙江和江蘇等4省共采集了5個三帶喙庫蚊野外種群，采集點信息見表1。

采集方法為棲息蚊捕捉法和牛帳誘法。其中QZNA、JHLH、TZPJ和LYGBP種群采用棲息蚊捕捉法采集，即在三帶喙庫蚊活動的高峰時段(一般在日落前1 h至日落后1 h)，選擇在豬或奶牛的廄舍內(nèi)，手電筒照明，使用電動吸蚊器在動物廄舍內(nèi)捕獲棲息的蚊蟲。HKML種群采用牛帳誘法采集，即在三帶喙庫蚊活動的高峰時段，選擇在離動物廄舍10～20 m的區(qū)域懸掛蚊帳，并將水牛用牛繩固定在帳內(nèi)活動，蚊帳懸掛要求為上下四角撐開并固定，使蚊帳下緣距地面25 cm 高，采集者手持電動吸蚊器和手電筒捕捉蚊帳內(nèi)蚊蟲。為減少對蚊蟲的損傷，每次捕獲蚊蟲數(shù)量達50只，便將捕獲的蚊蟲轉(zhuǎn)移至便攜式蚊籠中，將捕獲到的蚊蟲帶回實驗室正常飼養(yǎng)。

1.2 實驗試劑及儀器

殺蟲劑：溴氰菊酯，有效成分含量為98%；高效氯氰菊酯，有效成分含量為92%。兩種殺蟲劑均由中國疾病預(yù)防控制中心提供。實驗試劑：丙酮，分析純；DNA提取試劑盒(DNeasy Blood & Tissue Kit，Cat.No.69506)，QIAGEN，德國；PCR擴增試劑盒(DNA PCR Kit，Cat.No.R011)，TaKaRa，大連。蚊蟲采集和抗性生測的主要器材：蚊帳(規(guī)格：帳頂和帳底均為250 cm×250 cm，頂角至下沿的垂直高度200 cm，帳底開口距地面垂直距離25 cm)、電動吸蚊器、玻璃吸蚊管、250 mL惠頓瓶(Wheaton bottles)。

1.3 成蚊對殺蟲劑的敏感性測定

參照美國CDC生測瓶法(診斷劑量)，測定不同種群三帶喙庫蚊對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的敏感性，診斷劑量參考WHO推薦的藥膜接觸法中致倦庫蚊成蚊的診斷劑量，兩種殺蟲劑的診斷劑量均為0.05%，接觸時間均為1 h。

1.3.1測試瓶藥膜制備 選擇250 mL惠頓瓶(Wheaton bottles)，溫肥皂水清洗后，再用清水沖洗干凈，并充分晾干。根據(jù)殺蟲劑使用的診斷劑量，用丙酮配制相應(yīng)濃度的藥液，每個測試瓶中加入1 mL藥液，先蓋緊瓶蓋后晃動瓶中藥液，使其均勻布滿瓶子內(nèi)壁，然后取下瓶蓋，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)瓶身直到看不到明顯藥液，瓶子完全干燥，在瓶身和瓶蓋上標記藥膜濃度和配制時間，對照瓶中則只加1 mL丙酮。

1.3.2測試蚊蟲生理狀態(tài)及數(shù)量要求 通過牛帳誘法或在牲畜廄舍中采集得到的三帶喙庫蚊可能處于不同的生理狀態(tài)，包括飽血和非飽血蚊。因此，需將蚊蟲飼養(yǎng)1～2 d，待血液消化后再進行生測。

1.3.3生測過程 使用吸蚊管吸取10～25只雌性三帶喙庫蚊放入測試瓶中，立即蓋上瓶蓋并開始計時，在診斷時間范圍內(nèi)，每間隔一定時間，觀察記錄1次蚊蟲的擊倒數(shù)。然后將蚊蟲轉(zhuǎn)移至清潔蚊籠中正常飼養(yǎng)，24 h后觀察記錄死亡情況。每個濃度殺蟲劑測試重復(fù)4次，同時設(shè)置對照實驗，如對照瓶中蚊蟲24 h死亡率≥3%時，重做實驗。

1.4 自然種群kdr等位基因頻率檢測

1.4.1三帶喙庫蚊核酸提取，按試劑盒說明書進行操作。

1.4.2kdr基因擴增 利用特異引物擴增各種群三帶喙庫蚊鈉通道ⅡS4-ⅡS6 區(qū)段DNA 片段，該區(qū)段中的 L1014F突變位點是三帶喙庫蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的分子標記。上游引物 Tri5：5′-C T T C A C C G A C T T C A T G C A C TC-3′，下 游引物Tri6：5′-G A T T T T G G A C A A A A G C A A G GC-3′。

1.4.3PCR 反應(yīng)及測序 反應(yīng)總體積 50 μL，包括 Premix Taq(loading dye mix) 25 μL，模板 DNA 4.0 μL，上游引物(10 μmol/L)2.0 μL, 下游引物(10 μmol/L)2.0 μL，去離子水 17 μL。 反應(yīng)條件為 94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35 個循環(huán)；72 ℃，7 min；4 ℃保存。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，電泳的條件為120 V，30 mA， 電泳的時間為25 min。陽性結(jié)果直接送上海生工公司測序。

1.4.4kdr個體基因型的判讀kdr個體基因型可以根據(jù)測序結(jié)果峰圖進行判讀。當基因型為敏感純合子(SS)或抗性純合子(RR)時，突變位點峰圖為單峰；當基因型為抗性雜合子(SR)時，突變位點峰圖為雙峰。再結(jié)合堿基序列即可確定kdr個體基因型。

1.5 統(tǒng)計分析

三帶喙庫蚊對殺蟲劑的KT50值采用DPS (v15.10版)軟件計算，kdr等位基因頻率與KT50值之間的相關(guān)性采用SPSS 16.0軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 成蚊對殺蟲劑的敏感性

采用美國CDC生測瓶法測定了5個種群三帶喙庫蚊成蚊對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的敏感性。結(jié)果顯示：5個三帶喙庫蚊種群對0.05%溴氰菊酯的KT50值在2.17～16.96 min之間；接觸1 h后的擊倒率除JHLH種群為98.39%以外，其余種群均為100%；24 h死亡率均為100%。對0.05%高效氯氰菊酯的 KT50值在3.90～16.23 min之間；接觸1 h后的擊倒率和24 h死亡率均為100%(表2，表3)。

表2 不同種群三帶喙庫蚊成蚊對0.05﹪溴氰菊酯的敏感性Tab.2 Sensitivity of the adult Cx.tritaeniorhynchus to permethrin (0.05﹪)

表3 不同種群三帶喙庫蚊成蚊對0.05﹪高效氯氰菊酯的敏感性Tab.3 Sensitivity of the adult Cx.tritaeniorhynchus to betacypermethrin (0.05﹪)

2.2 kdr等位基因頻率檢測結(jié)果

kdr等位基因頻率及個體基因型頻率的檢測結(jié)果見表4。各種群三帶喙庫蚊kdr等位基因頻率在0～38.89%之間，QZNA種群未檢測到突變個體，HKML種群只檢測到1個RS個體。從基因型占比來看，抗性純合子(RR)在各種群中均較少，僅在LYGBP和JHLH種群中檢測到，兩個種群中RR個體在檢測樣本中所占比例分別僅為7.55%和11.11%；敏感純合子(SS)在各種群中所占比例較高，在55.56%～100%之間，其中QZNA種群所有檢測個體基因型均為SS型；雜合子(RS)在各種群中所占比例則為0～33.96%。

表4 5個野外種群三帶喙庫蚊 kdr 等位基因頻率Tab.4 Knockdown resistance (kdr) allele frequencies in five Cx.tritaeniorhynchus population

2.3 kdr等位基因頻率與KT50值之間的相關(guān)性分析

將不同種群三帶喙庫蚊成蚊kdr等位基因頻率與其對兩種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的KT50值作相關(guān)性分析。結(jié)果顯示三帶喙庫蚊成蚊kdr等位基因頻率與其對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的KT50值之間相關(guān)性顯著，且均為正相關(guān)關(guān)系，即三帶喙庫蚊成蚊kdr等位基因頻率越高，其對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的KT50值均越大。其中，kdr等位基因頻率與其對溴氰菊酯KT50值的相關(guān)系數(shù)為0.892，回歸方程為：y=5.378+30.451x，(P=0.042) (圖1)；kdr基因頻率與其對高效氯氰菊酯KT50值的相關(guān)系數(shù)為0.903，回歸方程為：y=5.480+27.573x(P=0.013)(圖2)。

圖1 三帶喙庫蚊 kdr 等位基因頻率與其對溴氰菊酯半數(shù)擊倒時間(KT50)之間的回歸曲線(P=0.042)Fig.1 Liner regression between kdr alleles frequency of Cx. tritaeniorhynchus strains and the KT50 value of deltamethrin (P= 0.042)

圖2 三帶喙庫蚊 kdr 等位基因頻率與其對高效氯氰菊酯半數(shù)擊倒時間(KT50)之間的回歸曲線(P =0.013)Fig.2 Liner regression between kdr alleles frequency of Cx. tritaeniorhynchus strains and the KT50 value of betacypermethrin (P = 0.013)

3 討論

目前，在我國開展的三帶喙庫蚊抗藥性水平的調(diào)查研究中，調(diào)查對象主要為幼蟲，為數(shù)不多的針對成蚊的調(diào)查研究結(jié)果顯示，各地三帶喙庫蚊成蚊對不同種類殺蟲劑也產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。例如山東省歷城區(qū)三帶喙庫蚊成蚊對0.05%溴氰菊酯(1 h)和0.05%高效氯氰菊酯(1 h)的24 h死亡率分別為85.0%和74.6%(陳云等，2012)；遼寧省東港市三帶喙庫蚊成蚊對0.05%溴氰菊酯(1 h)、0.25%氯菊酯(3 h)、1%殺螟硫磷(1 h)的24 h死亡率分別為15.9%、27.7%和8.2%(靳建超等，2012)。云南省昭陽、芒市、江城、孟連和元江等地的三帶喙庫蚊成蚊對0.05%溴氰菊酯(1 h)和4.00%DDT(1 h)的24 h死亡率分別在3.31%～59.22%和4.61%～86.76%之間(姜進勇等，2015)；江蘇省南京市、湖南省懷化市、廣東省清遠市、安徽省濉溪市三帶喙庫蚊成蚊對0.025%溴氰菊酯(1 h)的24 h死亡率在5.17%～75.25%之間(吳治明，2013)。

本次調(diào)查生測結(jié)果顯示海口美蘭(HKML)等5個種群三帶喙庫蚊成蚊對0.05%溴氰菊酯和0.05%高效氯氰菊酯的24 h死亡率均為100%。如果按照國家標準(GB/T 26347—2010)(中華人民共和國衛(wèi)生部等，2011)的判別標準，即24 h死亡率在98%～100%為敏感種群、在80%～97%表明其為可能抗性種群，<80%為抗性種群的，5個種群三帶喙庫蚊均可以判定為對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯敏感。但是從kdr等位基因頻率來看，除泉州南安種群(kdr等位基因頻率為0)可能對兩種殺蟲劑敏感外，其余5個種群(kdr等位基因頻率在2.00%～38.89%之間)對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯是具有一定抗性的。

蚊蟲抗性生物測定結(jié)果受到測定方法、試蟲狀態(tài)和測試環(huán)境等諸多因素的影響。本研究采用美國CDC生測瓶法進行蚊蟲抗性生物測定，其診斷劑量是參考WHO推薦的藥膜接觸法中致倦庫蚊成蚊的診斷劑量。兩種方法最大的區(qū)別在于藥劑附著的表面不同，WHO推薦的藥膜接觸法中的藥劑浸潤于濾紙中，濾紙相當于吸收表面，而美國CDC生測瓶法中的藥劑附著于玻璃瓶內(nèi)壁，玻璃內(nèi)壁相當于不吸收面，因此，在診斷劑量相同的情況下，美國CDC生測瓶法中蚊蟲在單位面積接觸到的有效藥量可能要比WHO推薦的接觸法中要高很多，蚊蟲死亡率就會偏高，診斷劑量抗性診斷作用失效，最終導(dǎo)致生物測定的結(jié)果與抗性基因檢測結(jié)果出現(xiàn)了不相匹配的情況。但是，從半數(shù)擊倒時間(KT50值)的角度進行分析發(fā)現(xiàn)，不同種群三帶喙庫蚊成蚊kdr等位基因頻率與其對兩種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的KT50值均呈正相關(guān)關(guān)系，即三帶喙庫蚊成蚊kdr等位基因頻率越高，其對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的KT50值均越大。因此，我們認為在使用美國CDC生測瓶法對三帶喙庫蚊成蚊進行抗性檢測時，0.05%溴氰菊酯(1 h)、0.05%高效氯氰菊酯(1 h)的診斷劑量偏高；此外，在死亡率判定失效的時候，可以通過比較KT50值的大小來比較不同種群之間抗性水平的差異。

參考以往關(guān)于三帶喙庫蚊幼蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性水平與kdr等位基因頻率之間關(guān)系的研究結(jié)果，在生物測定抗性倍數(shù)為1.70～54.70之間時，其對應(yīng)的kdr等位基因頻率在1.32～29.55之間(姜進勇，2015；Wuetal.，2016)。對本次研究中生物測定和抗性分子檢測結(jié)果進行綜合分析，推測出泉州南安(QZNA)種群三帶喙庫蚊對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯還處于相對敏感階段，?？诿捞m(HKML)種群已經(jīng)產(chǎn)生了部分抗性，臺州浦江(TZPJ)、連云港板鋪(LYGBP)和金華臨海(JHLH)種群的抗性程度相對較高。

由于三帶喙庫蚊極難飼養(yǎng)，其敏感品系成蚊對殺蟲劑的敏感基線或診斷劑量未見報道，以往的研究通常參考淡色庫蚊或致倦庫蚊成蚊的診斷劑量來對三帶喙庫蚊進行測試。由于診斷劑量會對檢測結(jié)果產(chǎn)生直接影響，因此，在使用不同的檢測方法時應(yīng)先通過預(yù)試驗來確定一個相對合適的診斷劑量。在抗性檢測的方法中，生物測定法、生化法和分子生物學(xué)方法各具優(yōu)勢，互相補充，測試評價簡單、實用、經(jīng)濟的測試方法極為必要。本研究中兩種抗性檢測方法均有值得推薦之處，其中分子生物學(xué)方法具有簡便、準確的優(yōu)點，它不僅可以了解蚊蟲抗藥性水平及其動態(tài)變化過程，還能預(yù)測蚊蟲的抗藥性發(fā)展過程。美國CDC生測瓶法則具有操作簡單、所需蚊蟲數(shù)量相對較少、經(jīng)濟實用等優(yōu)點(Galardoetal.，2015)。

本研究雖涉及到的殺蟲劑種類較少，還需要開展三帶喙庫蚊成蚊對其他種類殺蟲劑的抗性監(jiān)測研究，但研究結(jié)果同樣可以為上述地區(qū)的三帶喙庫蚊成蚊防制和農(nóng)藥使用策略提供科學(xué)依據(jù)。在抗性水平較高地區(qū)，當有流行性乙型腦炎疫情或三帶喙庫蚊密度高時，應(yīng)盡量減少溴氰菊酯和高效氯氰菊酯等擬除蟲菊酯類殺蟲劑的大量使用，可以選擇與其他殺蟲機制的殺蟲劑輪換使用。