王小明，蔣婷奇，方 蕾，譚躍浪，陳 浩

（1.浙江巨泰藥業(yè)有限公司；2.普洛藥業(yè)股份有限公司：浙江 衢州 324000）

頭孢克肟是一種口服的第3代頭孢菌素，抗菌譜廣，臨床上廣泛使用。頭孢克肟治療兒童細(xì)菌感染總有效率高于阿莫西林克拉維酸鉀[1]；用于治療小兒急性細(xì)菌性腸炎總有效率明顯高于頭孢克洛，已成為兒科常用的抗菌藥物[2]。但近年來(lái)，第3代頭孢菌素不良反應(yīng)發(fā)生率呈日趨增多，頭孢類(lèi)抗生素中存在的分子雜質(zhì)是引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原[3-4]。此類(lèi)抗生素用于注射用時(shí)必須控制產(chǎn)品中的高分子聚合物的含量。

頭孢克肟及其制劑聚合物檢測(cè)項(xiàng)在各國(guó)藥典中均未收載，目前《中國(guó)藥典》2015版收載的頭孢呋辛納、頭孢尼西鈉、頭孢噻肟鈉等聚合物檢測(cè)方法大多采用Sephadex G-10 凝膠色譜系統(tǒng)測(cè)定[5]。但該方法缺陷日益突出，如分析時(shí)間長(zhǎng)，樣品輔料干擾，聚合物無(wú)法完全締合從而檢出誤差大等[6]。因此建立TSK gel 2500PWxl 凝膠色譜系統(tǒng)檢測(cè)聚合物的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

頭孢克肟顆粒，生產(chǎn)商I，批號(hào)T41181202、T41181203、T41181204，規(guī)格50 mg；參比制劑頭孢克肟細(xì)粒，生產(chǎn)商II，DE061；規(guī)格50 mg；頭孢克肟原料，生產(chǎn)商III，批號(hào)AP004-1805-2048，頭孢克肟的質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%；頭孢克肟對(duì)照品，生產(chǎn)商IV，批號(hào)130503-201706，頭孢克肟計(jì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)89.2%。雜質(zhì)對(duì)照品信息見(jiàn)表1。

表1 雜質(zhì)對(duì)照品信息Tab 1 Information table of impurity reference substance

磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，分析純；乙腈，甲醇，色譜純；水，超純。

Agilent 1260 高效液相色譜儀，包括Agilent VWD、Agilent Openlab CDS 工作站；XS 105 電子天平，XPE26電子天平。

1.2 溶液的配制

樣品溶液：取本品適量（約相當(dāng)于頭孢克肟50 mg），置25 mL 量瓶中，加甲醇5 mL，振搖溶解5 min，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

對(duì)照品溶液：取頭孢克肟對(duì)照品約20 mg，精密稱(chēng)量，置50 mL 量瓶，加甲醇5 mL，振搖溶解5 min，用水稀釋至刻度，搖勻；再精密量取5 mL，置100 mL 量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)溶液：取樣品溶液適量，于70 ℃水浴加熱30 min，冷卻。

1.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性

以剛性、球形、親水的多孔聚甲基丙烯酸酯樹(shù)脂鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液（0.5 mol/L磷酸氫二鈉溶液、0.5 mol/L磷酸二氫鈉溶液體積比61:39）與乙腈（體積比97:3）為流動(dòng)相（流動(dòng)相1），體積流量0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30℃。精密量取系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)溶液中雜質(zhì)峰E（與頭孢克肟相對(duì)保留時(shí)間約為0.89）與頭孢克肟峰的分離度應(yīng)不低于1.0；系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)溶液中雜質(zhì)A 峰與頭孢克肟相對(duì)保留時(shí)間約為0.77；與頭孢克肟雜質(zhì)A峰相鄰的雜質(zhì)E 峰與頭孢克肟相對(duì)保留時(shí)間約為0.72，樣品溶液中保留時(shí)間小于雜質(zhì)E的聚合物雜質(zhì)峰與雜質(zhì)E峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。

1.4 流動(dòng)相選擇

頭孢克肟聚合物檢測(cè)項(xiàng)在各國(guó)藥典中均未收載，參考2015 年版《中國(guó)藥典》收載的頭孢地嗪鈉、頭孢米諾鈉聚合物的檢測(cè)方法，以剛性、球形、親水的多孔聚甲基丙烯酸酯樹(shù)脂鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（TSKgel G2500PWxl，7.8 mm×30 cm，7 μm），以磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相對(duì)頭孢克肟的聚合物進(jìn)行相關(guān)研究[5]。詳見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相配制Tab 2 Mobile phase preparation

1.5 色譜柱選擇

參考文獻(xiàn)[7]中頭孢克肟高分子雜質(zhì)的檢測(cè)條件，采用不同色譜柱、波長(zhǎng)對(duì)本品（頭孢克肟工作對(duì)照品）聚合物進(jìn)行考察。

色譜柱，正相柱，TOSOH TSKgel G2000HHR 30 cm×7.8 mm；色譜柱，反相柱，TSKgel G2500PWxl，7.8 mm×30 cm。流動(dòng)相DMF+30 mmol/L LiBr+10mmol/L H3PO4（流動(dòng)相7，DMF為N,N-二甲基甲酰胺），柱溫25 ℃，體積流量0.33 mL/min，樣品的質(zhì)量濃度2 g/L，進(jìn)樣量5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm（根據(jù)紫外吸收光譜，288 nm 處為最大吸收擬定）、280 nm（文獻(xiàn)條件）、254 nm（同類(lèi)品種聚合物測(cè)定波長(zhǎng)）。

1.6 測(cè)定方法及限度

精密量取對(duì)照品溶液、樣品溶液10 μL分別注入液相色譜儀，在系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)符合上述要求的條件下，記錄色譜圖。樣品溶液的色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，按外標(biāo)法以頭孢克肟峰計(jì)算。除溶劑峰外，所有保留時(shí)間小于雜質(zhì)E峰保留時(shí)間的雜質(zhì)總量不得過(guò)1.0%。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱選擇

按1.4節(jié)方法，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 色譜柱篩選Tab 3 Column screening

由表2 可知，按文獻(xiàn)條件用正相柱在288 nm波長(zhǎng)處測(cè)定的對(duì)照品的聚合物結(jié)果，與擬定條件用反相色譜柱在波長(zhǎng)288 nm 處測(cè)定的頭孢克肟工作對(duì)照品的聚合物結(jié)果基本一致，但雜質(zhì)個(gè)數(shù)反相柱更佳。但正相柱條件不適合于考察頭孢克肟相關(guān)制劑在熱水中聚合物的變化情況，且文獻(xiàn)條件流動(dòng)相中DMF的紫外截止波長(zhǎng)為268 nm，無(wú)法選擇254 nm 作為其檢測(cè)波長(zhǎng)，故頭孢克肟聚合物的測(cè)定未選擇文獻(xiàn)色譜條件作為檢測(cè)條件。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

由樣品紫外吸收光譜可知，樣品在288 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收；而同類(lèi)產(chǎn)品聚合物的檢測(cè)波長(zhǎng)均為254 nm，故比較在2種波長(zhǎng)條件下對(duì)頭孢克肟工作對(duì)照品的聚合物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，對(duì)照品在波長(zhǎng)288 nm 處測(cè)定的聚合物結(jié)果低于在波長(zhǎng)254 nm 處測(cè)定的聚合物結(jié)果，故參考同類(lèi)品種聚合物測(cè)定的波長(zhǎng)，選擇254 nm 為本品聚合物的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 流動(dòng)相選擇

在考察頭孢克肟顆粒在熱水中聚合物變化情況的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在熱水中降解產(chǎn)生的雜質(zhì)E峰與主峰以及聚合物峰分離較差，產(chǎn)生的雜質(zhì)E對(duì)聚合物的測(cè)定有一定的干擾，故對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行篩選，以排除可能產(chǎn)生的雜質(zhì)E對(duì)本品聚合物測(cè)定的干擾。因此，在該實(shí)驗(yàn)中對(duì)磷酸鹽緩沖液及有機(jī)相乙腈比例進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 流動(dòng)相篩選結(jié)果Tab 4 Mobile phase screening results

由表4可知，綜合考慮主峰保留時(shí)間、雜質(zhì)E與雜質(zhì)峰分離度、雜質(zhì)E與主峰分離度、主峰理論板數(shù)等相關(guān)指標(biāo)，選擇流動(dòng)相4作為頭孢克肟聚合物測(cè)定的流動(dòng)相，其色譜見(jiàn)圖1。

圖1 流動(dòng)相4色譜Fig 1 Chromatogram of mobile phase 4

2.4 專(zhuān)屬性

2.4.1 空白實(shí)驗(yàn)

取空白溶劑（質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%甲醇）過(guò)濾，直接進(jìn)樣；取樣品空白輔料約5 mg，置25 mL 量瓶中，加5 mL 甲醇振搖溶解5 min，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜，結(jié)果表明，空白溶劑、空白輔料不干擾本品聚合物測(cè)定。

2.4.2 系統(tǒng)適用性

取樣品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于頭孢克肟50 mg），置25 mL量瓶中，加5 mL甲醇振搖溶解5 min，加水稀釋至刻度，搖勻，于70 ℃水浴加熱30 min，冷卻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 頭孢克肟顆粒聚合物系統(tǒng)適用性結(jié)果Tab 5 Applicability results of cefixime granules polymer system

由表5可知，雜質(zhì)E峰（與頭孢克肟相對(duì)保留時(shí)間約為0.89）與頭孢克肟峰的分離度應(yīng)不低于1.0，各成分之間的分離度均符合要求。

2.4.3 雜質(zhì)定位

頭孢克肟特定雜質(zhì)（雜質(zhì)A、B、C、D、E、F）在聚合物條件下相對(duì)保留時(shí)間的確認(rèn)。

雜質(zhì)溶液：精密稱(chēng)取頭孢克肟雜質(zhì)A、B、C、D、E、F 約2 mg，分別置25 mL 量瓶中，加5 mL 甲醇溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。

藍(lán)色葡聚糖2000 樣品溶液：精密稱(chēng)取藍(lán)色葡聚糖2000（SLBW8211）約30 mg，置25 mL 量瓶中，加5 mL 甲醇溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 特定雜質(zhì)的定位研究結(jié)果Tab 6 Location study results of specific impurities

由表6可知，在聚合物含量統(tǒng)計(jì)中應(yīng)扣除特定雜質(zhì)。

2.5 定量限與檢測(cè)限

聚合物雜質(zhì)的定量限與檢測(cè)限以頭孢克肟定量限與檢測(cè)限代替。

按照要求，測(cè)定溶液中信噪比（S/N）約為3為檢測(cè)限，S/N約為10為定量限。

2.5.1 定量限

取頭孢克肟工作對(duì)照品適量（C16H15N5O7S2的質(zhì)量濃度4.04 mg/L），精密稱(chēng)定，加甲醇溶解，用水逐步稀釋?zhuān)瑸V過(guò)，進(jìn)樣測(cè)定，使頭孢克肟峰S/N≈10，作為定量限溶液。進(jìn)樣，計(jì)算精密度，結(jié)果詳見(jiàn)表7（A為峰面積）。

表7 聚合物定量限結(jié)果Tab 7 Results of quantitative limits of polymers

由表7 可知，峰面積和保留時(shí)間的精密度（RSD）分別為2%和0.11%，符合要求。

2.5.2 檢測(cè)限

取頭孢克肟工作對(duì)照品適量（C16H15N5O7S2的質(zhì)量濃度1.33 mg/L），精密稱(chēng)定，加甲醇溶解，用水逐步稀釋?zhuān)瑸V過(guò)，進(jìn)樣測(cè)定，使頭孢克肟峰S/N≈3，作為檢測(cè)限溶液。進(jìn)樣，結(jié)果詳見(jiàn)表8。

表8 聚合物檢測(cè)限結(jié)果Tab 8 Polymer detection limit results

由表8可知，信噪比大于3，符合要求。

2.6 線(xiàn)性與范圍

精密稱(chēng)取頭孢克肟對(duì)照品114.2 mg，置25 mL量瓶中，加10 mL 甲醇振搖5 min 溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，作為線(xiàn)性貯備液。取貯備液配制不同含量的線(xiàn)性溶液1～線(xiàn)性溶液6。取線(xiàn)性溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜。以濃度和峰面積計(jì)算線(xiàn)性方程，結(jié)果詳見(jiàn)表9。

由表9 可知，擬合線(xiàn)性方程為A/(AU·min)=[3 1017ρ/(mg·L-1)]+353.7，R2=1.000，RSD 為3.4%。頭孢克肟（以C16H15N5O7S2計(jì)）在質(zhì)量濃度4.04～2 423 mg/L內(nèi)與峰面積呈良好線(xiàn)性，符合驗(yàn)證要求，線(xiàn)性回歸系數(shù)符合≥0.999 的驗(yàn)證要求；y軸（峰面積）截距在測(cè)定含量的100%響應(yīng)量的2.0%以?xún)?nèi)，符合驗(yàn)證要求。

表9 聚合物線(xiàn)性與范圍Tab 9 Polymer linearity and range

2.7 精密度

2.7.1 重復(fù)性

取頭孢克肟對(duì)照品約20 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL 量瓶，加甲醇5 mL，振搖溶解5 min，用水稀釋至刻度，搖勻；再精密量取5 mL，置100 mL量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；另精密稱(chēng)取本品適量1.0 g（約相當(dāng)于頭孢克肟50 mg），置25 mL 量瓶中，加甲醇5 mL，振搖溶解5 min，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為樣品溶液，分別配制6份，由1名分析人員進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，6次測(cè)定聚合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.53%、0.53%、0.53%、0.52%、0.53%、0.53%，RSD為0.8%（≤5.0%）重復(fù)性良好。

2.7.2 中間精密度

由另一個(gè)分析人員使用不同的儀器配制6份相同含量的樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，6次測(cè)定聚合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.51%、0.52%、0.51%、0.51%、0.51%、0.51%，RSD為0.8%（≤5.0%），2人所得12 個(gè)聚合物結(jié)果的RSD 為1.9%（RSD≤5.0%），精密度良好。

2.8 耐用性

2.8.1 溶液穩(wěn)定性

取頭孢克肟聚合物測(cè)定樣品溶液，室溫放置，分別于0、1、2、4、6、8 h 進(jìn)樣，考察聚合物變化情況，結(jié)果表明，樣品溶液在室溫避光條件下放置，聚合物個(gè)數(shù)一致；聚合物含量逐漸增大，樣品溶液應(yīng)臨用新制。

2.8.2 色譜參數(shù)變動(dòng)

取樣品溶液，適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)及流速，考察色譜條件變化后的聚合物結(jié)果情況。結(jié)果表明：通過(guò)考察柱溫（±2 ℃）、檢測(cè)波長(zhǎng)（±2 nm）、體積流量（±0.05 mL/min）的改變，樣品聚合物個(gè)數(shù)與聚合物量均無(wú)明顯差異，本法耐用性良好。

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

3 批 頭 孢 克 肟 顆 粒T41181202、T41181203、T41181204，聚合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.094%、0.12%、0.12%。參比制劑（批號(hào)DE061）聚合物測(cè)定結(jié)果為0.086%，均符合限度要求（不超過(guò)1.0%）。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)不同色譜條件進(jìn)行篩選，建立TSK 凝膠色譜法測(cè)定頭孢克肟顆粒聚合物。通過(guò)分析方法驗(yàn)證，進(jìn)行專(zhuān)屬性中溶劑空白、輔料空白無(wú)干擾，聚合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)精密度中重復(fù)性與中間精密度在0.51%～0.53%，2 組結(jié)果RSD 為1.9%＜5.0%，在C16H15N5O7S2的質(zhì)量濃度4.04～2 423 mg/L時(shí)線(xiàn)性良好。溶液在常溫下放置不穩(wěn)定，需臨用現(xiàn)配，定量限、檢測(cè)限、耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合要求，表明本研究中建立的凝膠色譜法操作簡(jiǎn)單、專(zhuān)屬性強(qiáng)，對(duì)頭孢克肟顆粒聚合物測(cè)定方法提供借鑒。