張海燕，陳光輝，古麗扎爾·阿不都克力木，張秀英，王玉濤

（1喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆喀什 844000；2新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點實驗室，新疆喀什 8440000）

0 引言

葉蟬屬半翅目，角蟬總科(Membracoidea)，葉蟬科(Cicadellidea)昆蟲[1]。全世界已知 43亞科、2345 屬[2]，超過20000種[3]，中國24亞科[2]，約2000種[3]。葉蟬危害植物葉片、根莖部、韌皮組織造成直接損害，部分種類傳播植物病毒[4]，蔡平等[5]統(tǒng)計，植物病毒病媒介昆蟲世界范圍內(nèi)已知的約397種，其中葉蟬133種，將近1/3，傳播86種病原物[6]。害蟲種系的準(zhǔn)確鑒定影響防治方法的有效性[7]，但部分葉蟬體型和體色易隨發(fā)育階段或生境改變[8]，如廣頭葉蟬Macropsinae若蟲的體色、警覺性隨蟲齡變化[9]，也說明葉蟬在低齡期和若蟲期較易防治，但若蟲形態(tài)差異較小，鑒定較為困難。DNA條形碼技術(shù)補充了形態(tài)鑒定法的短板，能夠?qū)Σ煌l(fā)育歷期、不同形態(tài)、殘體昆蟲有效鑒定，岳巧云等[10]基于COI基因成功鑒定玉米象Sitophilus zeamais幼蟲。崔中翌等[11]基于CO1基因?qū)?43頭果蠅Drosophila melanogaster幼蟲或卵成功鑒定。Caterino等[12]利用COI和18S rDNA基因鑒定了伴閻甲亞科Histeridae的幼蟲。1993年Fang[13]首次用16SrRNA基因序列法研究了角頂葉蟬Dloctephaliane的系統(tǒng)發(fā)育。Johnson等[14]用16SrRNA、ND1和tRNA基因分析了紅額葉蟬屬Errhomus幾種葉蟬的種間親緣關(guān)系。Palomera、Bluemel[15-16]利用COI基因分別研究了玉米黃翅葉蟬Dalbulusmaidis和黃條脊冠葉蟬Aphrodes leafhoppers的遺傳多樣性。BOLD數(shù)據(jù)庫中記錄了1973種葉蟬，擁有條形碼的有1414種，4461條葉蟬的條形碼被記錄[17]。戴仁懷等[18]在2008年，基于28S rDNA D2、16S rDNA首次在國內(nèi)分析研究角頂葉蟬亞科進化關(guān)系。倪俊強等[19]基于COⅡ基因分析了閩桂地區(qū)尖凹大葉蟬Bothrogonia acuminata5個地理種群的進化地位。俞鵬飛等[20]采用引物步移法研究白邊大葉蟬Kolla paulula(Walker)線粒體基因組序列特征，發(fā)現(xiàn)白邊大葉蟬屬角蟬總科葉蟬科。喬利等[21]通過Cytb、COI基因，明確了信陽地區(qū)4種葉蟬種類、遺傳關(guān)系。中國對于葉蟬的DNA條形碼研究大多集中于對成蟲的研究，對葉蟬若蟲的研究較少。昆蟲幼蟲的形態(tài)分類是個難題[22]；COI基因進化速率快、序列保守，分子標(biāo)記效果較好[23-24]?；诖?，本研究首先通過形態(tài)分類，對未知葉蟬分類識別；提取葉蟬基因組，基于mt DNACOI基因，對提取的基因組用通用引物PCR擴增、測序；對目的基因序列用生物信息學(xué)軟件進行相似性分析、計算種間距離、分析遺傳進化地位，獲得不同種類葉蟬快速鑒定的DNA條形碼。南疆與多國接壤，較容易遭生物入侵，作為農(nóng)業(yè)大區(qū)，植被種類多，易于葉蟬生存，但區(qū)域內(nèi)葉蟬分類識別基礎(chǔ)薄弱，研究葉蟬DNA條形碼的報道更為少見。本研究選用COI基因?qū)?種葉蟬若蟲和2種成蟲進行分類鑒定，可豐富邊境地區(qū)葉蟬基因數(shù)據(jù)庫、為維護生物安全和害蟲有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

本研究葉蟬樣本分布于新疆部分農(nóng)田，用捕蟲網(wǎng)掃捕、黃板誘捕獲得（表1）。首先形態(tài)分類鑒定，初步分為6種葉蟬標(biāo)本，標(biāo)記為A、B、C、D、E、F，在離心管中加入99%的無水乙醇，將標(biāo)本放入離心管，冷藏于4℃冰箱中，實驗于2020年5—10月在新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點實驗室開展。

表1 葉蟬標(biāo)本信息

1.2 儀器設(shè)備

體視顯微鏡(Motic Cam2506 SMZ168)、離心機(BECKMAN COULTERTM AllegraTM X-22R Centrifuge)、FM100 雪花制冰機(YKKY)、振蕩器(IKA MS3 digital)、恒溫水浴鍋、PCR儀（Veriti TM 96-Well PCR 4375786新加坡制造）、伯樂Bio-RadPowerpacHC電泳設(shè)備、凝膠成像儀(Bio-Rad Molecular Imager Gel Doc XR)等。

1.3 提取葉蟬DNA基因組

由于葉蟬若蟲體型較小，為保證基因組提取效果，參照鄒志文等Chelex100改進法提取葉蟬DNA[25]。

（1）取1只葉蟬，用雙蒸水在離心管中將樣本清洗數(shù)次，后將樣本置于濾紙上數(shù)分鐘直至干燥。

（2）將干燥的葉蟬樣本放入離心管中(1.5 mL)，對玻璃棒高壓滅菌后緊貼管壁充分研磨樣本。

（3）吸取0.5 mL雙蒸水（已滅菌），加入裝有葉蟬樣本的離心管中，充分渦旋溶液至均勻，放入-70℃冰箱中冷卻4 min。

（4）將離心機參數(shù)設(shè)置為12000 r/min，將溶液離心5 min，緩慢抽取上清棄去，只留下沉淀，重復(fù)此步驟3次。

（5）將5%的Chelex-100溶液搖勻，抽取120 μL，加入到沉淀中，調(diào)整恒溫水浴鍋的溫度為56℃，將溶液搖勻后加熱2 h。

（6）渦旋5～10 s，將離心管封口（防止溶液噴濺）放入100℃的恒溫水浴鍋，加熱10 min。

（7）渦旋溶液 5～10 s，將離心機參數(shù)設(shè)置為10000 r/min，將溶液離心5 min，提取離心所得上清液，在-20℃條件下保存，作為DNA模板。

1.4 基因組PCR擴增

引物由北京奧科生物公司合成，上游引物L(fēng)CO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，下游引物 HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGAC CAAAAAATCA-3’[26-28]。使用通用引物對COI序列PCR擴增，擴增體系總體積設(shè)置為21 μL，其中2×Taq酶7.2 μL，ddH2O 12 μL，上下游引物各為0.4 μL，DNA模板1 μL。反應(yīng)條件及步驟為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)40次，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7 min，4℃條件下保存。PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.5 處理數(shù)據(jù)、構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

將擴增的目的基因送專業(yè)測序公司測序，經(jīng)測序儀生成abi文件，首先用Chromas 2.6.6軟件打開測序獲得的基因序列的峰圖，查找誤讀的堿基手動校正。用DNAMAN4.0軟件進行序列正反鏈拼接匹配校正。用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST程序比較序列同源性，確定所測序列屬昆蟲COI基因序列。下載Score較高、Query cover大于90%、Per ident高于80%的序列，用ClustalX 1.83軟件比對下載序列與測序所得序列。用MEGA7.0.14統(tǒng)計序列堿基組成、變異位點、核苷酸組成。選用Kimura 2-Parameter模型計算種間遺傳差異，用DAMBE7.2.136基于P距離分析序列堿基替換飽和性、檢測系統(tǒng)發(fā)育信號。用NJ鄰接法(Neighbour-Jioning)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，循環(huán)1000次，估計進化樹中節(jié)點的置信度(bootstrap confidence level，BCL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉蟬標(biāo)本初步形態(tài)鑒定

參照表2中葉蟬成蟲及若蟲的形態(tài)特征及6個葉蟬樣本的外部形態(tài)，初步劃分樣本所屬類群，經(jīng)分析所研究樣本分屬6個亞科，6種葉蟬背面、側(cè)面、腹面形態(tài)特征見圖1。

圖1 6種葉蟬形態(tài)特征圖

表2 6種葉蟬形態(tài)特征

續(xù)表2

2.2 序列分析

本研究獲得葉蟬核酸序列共6條，其中4種葉蟬若蟲（樣本A、B、C、D）的4條序列屬首次獲得，2種葉蟬成蟲（樣本E、F）的2條COI序列在新疆首次報道。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序，發(fā)現(xiàn)與該序列同源性最高的是昆蟲的COI基因序列，確定所測序列為COI基因序列。下載GeneBank中與該COI序列同源性較高的葉蟬的序列，將測序獲得序列與下載序列用ClustalX1.83軟件比對分析，非保守區(qū)域去除，測序拼接后僅以表6中的序列長度進行分析。COI基因核苷酸組成見表3，本研究6個樣本的COI序列的A+T含量分別為65%、72%、67%、69%、67%、68%，COI基因的A+T含量高于G+C，A+T堿基偏移性明顯，與昆蟲mt DNA基因堿基構(gòu)成特點一致，成功對葉蟬樣本的COI基因序列在分子水平上監(jiān)測分析。

表3 mt DNA核苷酸堿基組成表

2.3 分子鑒定結(jié)果分析

將獲得的葉蟬樣本的COI序列在GenBank中進行比對，可獲得相似度高低排列表，結(jié)果顯示均和葉蟬相關(guān)序列的相似性最高。COI序列覆蓋度大于90%、相似度大于95%，被認定為達到鑒定標(biāo)準(zhǔn)[39]。COI序列相似度大于98%被認為達到鑒定標(biāo)準(zhǔn)或水平[40]。本研究獲得的6條COI基因序列中，3個葉蟬樣本與NCBI中相關(guān)序列相似度高達98%，大于或等于鑒定標(biāo)準(zhǔn)98%，可以鑒定為該類昆蟲，鑒定依據(jù)和結(jié)果如表4所示。樣本A與KR564712.1條沙葉蟬Psammotettix confinis COI基因的相似度為99.02%，確定為條沙葉蟬。樣本B與MF716879.1大青葉蟬Cicadella viridis COI基因的相似度為99.09%%，確定為大青葉蟬。樣本E與JQ755806.1多態(tài)廣頭葉蟬Macropsis notate COI基因的相似度為100%，確定為多態(tài)廣頭葉蟬。樣本C與HQ929177.1紅帶鏟頭葉蟬Hecalus arcuatus的相似度只有85.5%，未達到鑒定標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)形態(tài)特征鑒定初步鑒定為鏟頭葉蟬亞科Hecalinae鏟頭葉蟬屬Hecalus Stal葉蟬，由于該樣本為若蟲，尚未發(fā)育完全，形態(tài)特征不明顯，無法將其鑒定到種，故該葉蟬鑒定為鏟頭葉蟬屬葉蟬。樣本D與KR560629.1斑葉蟬族Erythroneura vitifex的相似度只有87.7%，未達到鑒定標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)形態(tài)特征鑒定初步鑒定為阿小葉蟬屬Arboridia Zachvathin葡萄阿小葉蟬Arboridia kakogawana，（斑葉蟬屬Erythroneura和阿小葉蟬屬Arboridia均屬斑葉蟬族）。樣本F與JF737032.1六點葉蟬Macrosteles sexnotatus的相似度最高，達到91.92%，但未達到鑒定標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)形態(tài)特征鑒定初步鑒定為殃葉蟬亞科Euscelinae二叉葉蟬屬MacrostelesFieber六點葉蟬Macrosteles sexnotatus，形態(tài)特征與分子鑒定結(jié)果一致，該葉蟬為六點葉蟬。本研究中葉蟬樣本的形態(tài)特征鑒定結(jié)果與分子鑒定結(jié)果基本一致，樣本C、D、F的COI基因序列相似度與NCBI中相關(guān)葉蟬的相似度存在一定的差距，與樣本的蟲態(tài)、新疆對葉蟬的條形碼研究較少數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)不夠全面有關(guān)。

表4 葉蟬樣本COI基因鑒定依據(jù)及結(jié)果

2.4 堿基替換飽和性分析

啟動DAMBE7.2.136軟件，P距離位于橫軸，轉(zhuǎn)換(s)和顛換(v)位于縱軸，繪制函數(shù)曲線圖，以此檢測堿基替換是否飽和[41]，詳見圖2。由圖2可知COI序列組的轉(zhuǎn)換值隨著P距離增加而升，與P距離存在較強的線性關(guān)系，可知本研究中序列堿基替換未飽和，可進行系統(tǒng)進化地位分析[41]。

圖2 葉蟬COI基因序列堿基替換飽和性

2.5 葉蟬系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫篩選下載覆蓋度大于90%、同源性80%以上的葉蟬科昆蟲的COI基因序列，與實驗所得序列，用MEGA7.0.14構(gòu)建COI葉蟬部分屬種NJ分子進化樹（圖3）。本研究分析的6種葉蟬在系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置清晰，分類明確，各種在各分類階元間形成各自獨立的單系。本研究樣本的CO1序列和葉蟬類昆蟲相關(guān)序列分為2個大支，屬間以亞科為分支聚類為6個小支，和已知葉蟬相關(guān)序列以較高置信值聚在一起，明顯將6種葉蟬準(zhǔn)確區(qū)分開來。阿小葉蟬屬位于進化樹的根部，是葉蟬科最為原始的類群[42]。

圖3 與葉蟬相關(guān)的部分種類的COI基因系統(tǒng)進化NJ樹（數(shù)字表示置信度，用紅色菱形標(biāo)注樣本）

2.6 遺傳距離分析

用MEGA 7.0.14軟件，基于K2P距離模型，計算6種葉蟬不同個體的COI基因序列間的遺傳距離，如表5所示。6種葉蟬種間遺傳距離為0.183～0.265，種間遺傳距離平均數(shù)為0.232；鑒定到種的樣本A、B、E種內(nèi)遺傳距離分別為0.0037、0.0019、0.0037，遠低于0.01。種內(nèi)平均遺傳距離小于0.01，種間平均遺傳距離大于0.2，符合“10倍閾值定律”[40]且與形態(tài)分類結(jié)論一致[43]，對6種葉蟬成功分類鑒定，因此，這些mt DNA序列可以作為鑒定葉蟬科昆蟲的DNA條形碼[44]。

表5 6種葉蟬COI基因種間遺傳距離

3 討論

3.1 葉蟬mt DNA堿基組成特征

本研究中6個樣本的COI基因序列A+T含量明顯高于G+C，表現(xiàn)出明顯的A/T堿基偏嗜，與昆蟲線粒體基因序列堿基組成特點一致[45]。高婭蓉等研究小葉蟬亞科5個族的COI基因片段序列時得出小葉蟬亞科5個族A+T含量為69.2%，含量較高[46]，與本研究結(jié)果一致。確定了mt DNACOI基因序列可作為葉蟬的DNA條形碼，獲得COI基因序列6條，其中4條葉蟬若蟲的COI基因序列為葉蟬科昆蟲首次報道，2條葉蟬成蟲序列為新疆首次報道。

3.2 葉蟬mt DNA分子鑒定結(jié)果

本研究中樣本C、D、F的COI基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中相關(guān)葉蟬的COI基因序列相似度之間有一定差距，未達到鑒定水平。經(jīng)查證葡萄阿小葉蟬COI基因序列在各類網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中均未記錄，故本研究中獲得的樣本D葡萄小葉蟬的COI基因序列與斑葉蟬族葉蟬相似度較低。另外新疆溫差較大、干燥少雨、光照強，地理環(huán)境特殊，區(qū)域內(nèi)相關(guān)昆蟲研究較少，獲得的數(shù)據(jù)未在條形碼數(shù)據(jù)庫中登記，造成新疆葉蟬科昆蟲在GenBank數(shù)據(jù)庫中序列不全，相似度低；另一方面在實驗過程中因機器或人工的中間環(huán)節(jié)較多，影響實驗結(jié)果，而給鑒定結(jié)果造成一定誤差，數(shù)據(jù)被誤傳到數(shù)據(jù)庫，造成同一物種相似度存在差異。

3.3 葉蟬mt DNA基因的遺傳距離

研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)物種間的COI基因序列之間存在相對較小的種內(nèi)遺傳距離和相對較大的種間遺傳距離，98%以上的種間遺傳距離大于2%，而種內(nèi)遺傳距離大多低于1%，很少超過2%[47-48]。本研究6種葉蟬種間遺傳距離平均數(shù)為0.232，樣本A、B、E種內(nèi)遺傳距離平均數(shù)為0.0031，遠低于1%，達到鑒定標(biāo)準(zhǔn)。樣本E與F的遺傳距離最大為0.265，樣本A與C的遺傳距離最小為0.183，來自吐魯番的樣本D與來自喀什、克州的其他樣本的地理距離最遠，但遺傳距離并不是最大的，田小娟指出地理間距和遺傳差異之間無相關(guān)性[49]，地理距離不會必然導(dǎo)致種群間的遺傳分化[49]。李樂對12種假眼小綠葉蟬的研究發(fā)現(xiàn)，全國不同地理位置、海拔和氣候的假眼小綠葉蟬種群間遺傳變異不明顯[50]，與本研究結(jié)果一致。本研究中地理環(huán)境并不是引起葉蟬遺傳結(jié)構(gòu)差異的主要原因，但本研究采集的樣本地域覆蓋度還較低，不能代表該區(qū)域的葉蟬遺傳結(jié)構(gòu)與地理環(huán)境的關(guān)系，今后將擴大邊境區(qū)域及周邊采樣范圍，以期更全面評估該區(qū)域葉蟬遺傳多樣性、分布特點等。

4 結(jié)論

本研究基于mt DNACOI基因，首先通過形態(tài)分類法確定葉蟬的大致類群，再利用DNA條形碼技術(shù)，獲得葉蟬COI基因序列，比對序列相似性，分析堿基含量、檢測系統(tǒng)發(fā)育信號、計算遺傳距離、構(gòu)建系統(tǒng)進化關(guān)系，確定了6條mt DNACOI基因序列可作為葉蟬快速鑒定的DNA條形碼，其中4種葉蟬若蟲的基因序列為葉蟬科昆蟲首次研究報道。本研究獲得如下結(jié)論：（1）經(jīng)形態(tài)特征鑒定，6個樣本分屬6個亞科、6個屬、6種葉蟬；（2）葉蟬的mt DNA基因序列構(gòu)成特點與昆蟲的mt DNA序列堿基組成特點一致；（3）通過mt DNA序列對比、遺傳距離分析、系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建，確定了本研究6種葉蟬的種類，與形態(tài)分類結(jié)果一致，獲得基因序列可作為本區(qū)域6種葉蟬快速鑒定的DNA條形碼。