趙 爽，王 歡，卜曉英，董愛文

（吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界 427000）

0 引言

爬山虎(Parthenocissus tricuspidataPlanch)系葡萄科(Vitaceae)爬山虎屬(Parthenocissus)多年生大型落葉木質(zhì)藤本植物，耐貧瘠，耐旱，生長速度快，莖葉覆蓋率高，對大氣中SO2、Cl2、F2、Pb、Cr、Cd以及土壤中重金屬離子有較強(qiáng)抗性和富集作用[1-2]，不僅可用于綠化、美化，也可遮陰、增氧、降溫、增濕、滯塵、殺菌、減弱噪聲和保護(hù)建筑物等功效[3-5]，是藤本類植物中用得最多的綠化材料之一，也是目前最理想、應(yīng)用最多的城市垂直綠化植物品種[6]。其一年生莖上各型吸盤緊貼墻壁，帶來的觀賞性價(jià)值非常之高，植物新長出的葉子多數(shù)是偏綠的，然而秋天該植物葉子逐漸變成磚紅色，金黃色或亮橙色，成為城市一道靚麗的風(fēng)景線[7-8]。

不定根發(fā)生的研究是發(fā)育生物學(xué)的重要領(lǐng)域，但其自發(fā)生根與誘導(dǎo)生根在生理上存在較大差異，而木本植物莖生根的研究——以插條、組織培養(yǎng)和空中壓條形成愈傷組織生根為研究手段。而插穗經(jīng)不同激素處理生根[9-10]與不同條件下插穗生根等研究方法[11-12]；以及利用LED調(diào)制光質(zhì)促進(jìn)不定根生成[13-14]；還有利用加溫解除插穗休眠促進(jìn)生根[15]及基因在插條不定根發(fā)育中的作用[16]；組織培養(yǎng)具有遺傳穩(wěn)定性高、繁殖速度快等優(yōu)點(diǎn)，因此也是實(shí)現(xiàn)木本植物無性繁殖的主要方式[17-18]；此外空中壓條也是實(shí)現(xiàn)木本植物無性繁殖的有效方法[19-21]。而爬山虎生根方面：依據(jù)根冠平衡理論采取高空壓條促進(jìn)其木質(zhì)藤本莖上產(chǎn)生不定根，以此打破其莖的生長高度限制的研究[22]。組培方面有利用爬山虎引進(jìn)的種子無菌苗對爬山虎組織培養(yǎng)中存在問題的研究[23]。此外，還有利用爬山虎半木質(zhì)化嫩枝在濃度為10-7左右的NAA中處理，扦插成活率比較高[24]，以及用植物生長素與激動(dòng)素對爬山虎嫩枝扦插生根的影響[25]和采用不同植物催根劑、不同濃度、不同基質(zhì)配方和扦插方法研究‘花葉’爬山虎扦插繁殖[26]等的研究。這些主要是研究誘導(dǎo)木質(zhì)莖生根的機(jī)制，然而，自發(fā)生根和誘導(dǎo)生根的植物或組織在不定根發(fā)生過程中存在較大的生理差異，有關(guān)自發(fā)誘導(dǎo)生根機(jī)理方面報(bào)道極少，木本植物莖在自然生長時(shí)自發(fā)產(chǎn)生不定根的機(jī)理研究還未見報(bào)道。因此本研究檢測分析城市垂直綠化常用的爬山虎在巖石壁上自然生長時(shí)，其木質(zhì)藤本莖上自發(fā)產(chǎn)生不定根時(shí)根原基發(fā)生及木質(zhì)部中4種內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化，來探索它們在自發(fā)產(chǎn)生不定根時(shí)的作用，為依據(jù)根冠平衡理論，打破其攀援莖生長高度限制，更好應(yīng)用于城市垂直綠化及礦山高陡巖質(zhì)邊坡的生態(tài)修復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理步驟

選擇吉首大學(xué)張家界校區(qū)內(nèi)3～5 m高的巖石護(hù)墻上自然生長的爬山虎作為實(shí)驗(yàn)材料，于2019年4月開始萌芽生長的不同生長齡目標(biāo)植株作出標(biāo)記并進(jìn)行記錄。分別于2019年6月8日、7月8日和8月8日攜液氮采樣，其中7月8日所采樣品速凍處理后送上海酶聯(lián)生物科技有限公司檢測；6月中旬開始確定一年生未生根爬山虎莖后標(biāo)記并外施激素以及形態(tài)解剖觀測莖內(nèi)細(xì)胞生長發(fā)育的變化，于8月8日攜液氮采樣莖木薄壁細(xì)胞已反分化的一年生爬山虎莖并測定其木質(zhì)部中4種激素的含量。

1.2 試驗(yàn)方法

采集自然生長爬山虎莖后去掉枝葉并剪成長20 cm的切段并標(biāo)記后放入液氮中，回實(shí)驗(yàn)室后在-40℃的超低溫冰柜中保存24 h，用干冰包埋后12 h內(nèi)送達(dá)上海酶聯(lián)生物科技有限公司檢測。在超低溫冰柜中撕去表皮等只留下木質(zhì)部，取每切段中間10 cm左右約5.0 g的試材，在冷凍混合球磨儀(Retsch MM400)內(nèi)研磨，每個(gè)處理重復(fù)3次，收集到50 mL離心管內(nèi)，再加入約40 mL冷甲醇置于4℃條件下浸提7 h以上，4℃、8000 r/min、10 min離心后，過濾，收集到50 mL小燒杯冷凍濃縮至1/3左右，用0.5 mol/L Na2HPO4調(diào)至pH 8.0，石油醚萃?。ㄖ辽?次）以去除酚類等物質(zhì)，取水相加入0.1gPVPP（聚乙烯吡咯烷酮），160r/min35min搖床震蕩后過濾，用2 mol/L檸檬酸調(diào)至pH 3.0，乙酸乙酯萃取3次，取酯相于冷凍干燥機(jī)(SCIENTZ-10ND)中干燥至粉末，加入pH 3.0的磷酸鹽溶液溶解，C18固相萃取小柱純化待測樣品，冷凍干燥至粉末，按照試劑盒要求用冷色譜純甲醇配制待測樣品溶液。

外施植物激素的爬山虎一年生莖的形態(tài)解剖觀測：按卜曉英等[27]的方法進(jìn)行冷凍切片并制作熒光顯微切片，制好切片后用帶365 nm的μ激發(fā)光濾色片及相應(yīng)吸收濾色片的BHS-312熒光顯微鏡(OLYMPUS)觀察并拍片。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件計(jì)算爬山虎莖木質(zhì)部內(nèi)激素的OD均值標(biāo)準(zhǔn)差與均值。利用IBM SPSS Statistics 19軟件對爬山虎莖內(nèi)激素OD值進(jìn)行方差分析(ANOVE)，差異顯著性運(yùn)用Duncan's檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析。利用Origin Pro 8對回歸方程計(jì)算出的濃度數(shù)據(jù)處理并用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 外施激素莖的解剖結(jié)構(gòu)

一年生未生根爬山虎的莖在外施激素后，其維管束間薄壁細(xì)胞反分化前狀態(tài)、不定根原基的形成、生長發(fā)育以及不定根突破皮層與表皮，見解剖圖1、2與3，從熒光顯微圖1中可以看出外施激素后7～10天左右的時(shí)間，莖維管束間不同位置的薄壁細(xì)胞（圖1、2）出現(xiàn)明顯的內(nèi)源物質(zhì)變化；而從維管束間薄壁細(xì)胞反分化到不定根原基形成（圖2）大約需要10～15天的時(shí)間；不定根原基形成后其生長發(fā)育突破皮層與表皮大約需要5～15天的時(shí)間（圖3）。因此，選擇在外施激素后20天左右的一年生莖作為檢測試材。從圖1與圖2可以看出爬山虎一年生莖產(chǎn)生不定根起源于莖的維管束間，因此屬于內(nèi)起源，而圖4、5及多年生莖上不定根的產(chǎn)生是否也是內(nèi)起源有待進(jìn)一步研究。

圖1 一年生爬山虎莖束間木薄壁細(xì)胞的萌動(dòng)(×100)

圖2 一年生爬山虎莖中不定根原基形成與發(fā)育(×100)

圖3 一年生爬山虎莖中不定根生長發(fā)育突破皮層與表皮(×100)

2.2 酶聯(lián)公司檢測結(jié)果

7月8日送上海酶聯(lián)生物科技有限公司檢測的樣品（圖4～6為部分采樣品），其ELISA檢測OD值見表1。表中：樣品1為3年生全莖生根的爬山虎莖；樣品2為3年生未生根的爬山虎莖；樣品3為5年生未生根的爬山虎莖；樣品4為3年生節(jié)上生根的爬山虎莖；樣品5為5年生全莖生根的爬山虎莖；樣品6為一年生節(jié)上生根的爬山虎莖；樣品7為一年生未生根的爬山虎莖；樣品8為5年生節(jié)上生根的爬山虎莖；樣品9為一年生未生根外施激素后生根的爬山虎莖，其ELISA檢測OD值為8月8日自測值。數(shù)據(jù)利用Excel軟件計(jì)算其均值和標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果見表1。

表1 酶聯(lián)生物科技有限公司檢測結(jié)果

圖4 五年生全莖生根的爬山虎

圖5 三年生節(jié)上生根與逐步全莖生根的爬山虎

圖6 一年生節(jié)上生根的爬山虎

表中OD值顯示4種內(nèi)源激素均在全莖生根的爬山虎莖木質(zhì)部內(nèi)的含量高于節(jié)上生根的爬山虎莖木質(zhì)部內(nèi)的含量高于未生根的爬山虎莖木質(zhì)部內(nèi)的含量，這是否說明爬山虎自然生長時(shí)其莖上自發(fā)產(chǎn)生不定根需要多種內(nèi)源激素協(xié)同作用有待進(jìn)一步研究。

2.3 爬山虎生長莖自發(fā)產(chǎn)生不定根時(shí)莖內(nèi)4種內(nèi)源激素的濃度

根據(jù)6月8日、7月8日與8月8日檢測的OD值（平行三）以及各次建立的回歸方程計(jì)算出對應(yīng)的激素濃度，利用Origin Pro 8對濃度數(shù)據(jù)處理并利用Excel軟件作圖，見圖7～10（圖中樣品1是一年生節(jié)上生根的爬山虎莖、樣品2是一年生未生根的爬山虎莖、樣品3是一年生未生根的爬山虎莖外施激素后生根的莖、樣品4是3年生全莖生根的爬山虎莖、樣品5是3年生節(jié)上生根的爬山虎莖、樣品6是3年生未生根的爬山虎莖、樣品7是5年生全莖生根的爬山虎莖、樣品8是5年生節(jié)上生根的爬山虎莖、樣品9是5年生未生根的爬山虎莖）。

圖7顯示各試材木質(zhì)部中IAA的濃度均很高，以鮮重計(jì)最高的為3年生全莖生根莖木質(zhì)部中達(dá)11.486 μg/g，最低的為一年生未生根莖為 6.255 μg/g，但不生根一年生莖在外施激素后自發(fā)產(chǎn)生不定根時(shí)木質(zhì)部內(nèi)IAA的濃度增長至10.935 μg/g，遠(yuǎn)高于木本植物莖內(nèi)0.001～1.000 μg/g的值；并有隨不定根的產(chǎn)生、生長、突破皮層與表皮時(shí)IAA含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢；同時(shí)全莖生根莖木質(zhì)部內(nèi)IAA濃度＞節(jié)上生根莖木質(zhì)部內(nèi)IAA濃度＞未生根莖木質(zhì)部內(nèi)IAA濃度。

圖7 爬山虎不同生長狀態(tài)莖中IAA的平均含量

圖8顯示各試材木質(zhì)部中CTK的濃度以鮮重計(jì)最高的是一年生不生根莖（CTK為150.235 ng/g）在外施激素后自發(fā)產(chǎn)生不定根時(shí)的232.295 ng/g，最低的為5年生不產(chǎn)生根的莖木質(zhì)部內(nèi)的137.930 ng/g；莖內(nèi)CTK濃度有隨不定根的產(chǎn)生、生長、突破皮層與表皮過程呈下降的趨勢；同時(shí)全莖生根的莖木質(zhì)部內(nèi)CTK的濃度＞節(jié)上生根莖內(nèi)CTK濃度＞未生根莖內(nèi)CTK濃度。

圖8 爬山虎不同生長狀態(tài)莖中CTK的平均含量

圖9顯示各試材木質(zhì)部中JA的濃度遠(yuǎn)低于植物營養(yǎng)器官按鮮重計(jì)10～100 ng/g的范圍，但各生根莖的木質(zhì)部內(nèi)的濃度遠(yuǎn)高于不生根莖木質(zhì)部內(nèi)的濃度。

圖9 爬山虎不同生長狀態(tài)莖中JA的平均含量

圖10顯示各試材木質(zhì)部內(nèi)Me-JA的濃度極微，但各生根莖的木質(zhì)部內(nèi)的濃度遠(yuǎn)高于不生根莖木質(zhì)部內(nèi)的濃度。從圖7～10中還可發(fā)現(xiàn)一年生未產(chǎn)生不定根的莖在外施激素后木薄壁細(xì)胞反分化形成不定根原基及其發(fā)育生長突破皮層與表皮時(shí)，莖木質(zhì)部內(nèi)4種激素的濃度均出現(xiàn)大幅增長，說明爬山虎自然生長莖自發(fā)產(chǎn)生不定根時(shí)需要多種激素的協(xié)同作用。

圖10 爬山虎不同生長狀態(tài)莖中Me-JA的平均含量

3 討論

不定根發(fā)生研究是發(fā)育生物學(xué)的重要領(lǐng)域，自發(fā)性生根和誘導(dǎo)性生根的植物或組織在不定根發(fā)生過程中存在較大的生理差異，木本植物莖生根主要以插條、組培和空中壓條過程形成愈傷組織的生根，插穗經(jīng)不同激素處理[9-10]與不同條件下插穗生根等研究方法[11-12]以及基因調(diào)控[28]的愈傷組織生根是木本植物莖上生根研究的熱點(diǎn)，這些研究主要是集中在誘導(dǎo)生根的機(jī)制方面，然而，有關(guān)自發(fā)誘導(dǎo)生根機(jī)理方面報(bào)道太少。已有爬山虎木質(zhì)藤本莖生根研究的報(bào)道也是以空中壓條[22]、組培[23]和插條[24-25]過程形成愈傷組織的生根，以及采用不同植物催根劑、不同濃度、不同基質(zhì)配方和扦插方法研究‘花葉’爬山虎扦插繁殖[26]等的研究。而對爬山虎多年生未離體未破莖的生長莖上不定根自發(fā)產(chǎn)生的機(jī)制方面還未見報(bào)道。因此本研究開展爬山虎生長于巖石壁上的木質(zhì)藤本莖內(nèi)薄壁細(xì)胞自動(dòng)反分化致其木質(zhì)藤本莖內(nèi)不定根原基自然發(fā)生及其相關(guān)研究，將豐富木本植物莖上生根的基礎(chǔ)理論。

本研究通過解剖爬山虎一年生未產(chǎn)生不定根的木質(zhì)莖外施激素后產(chǎn)生不定根原基時(shí)的結(jié)構(gòu)，獲得其起源于維管束間薄壁細(xì)胞的反分化（圖1～2），并檢測了全莖生根莖、節(jié)上生根莖與不生根莖木質(zhì)部中4種內(nèi)源激素的濃度，結(jié)果表明自發(fā)產(chǎn)生不定根的莖木質(zhì)部內(nèi)4種內(nèi)源激素濃度均明顯高于不生根的莖，且一年生不產(chǎn)生不定根的木質(zhì)莖外施激素后產(chǎn)生不定根原基時(shí)木質(zhì)部中4種內(nèi)源激素也大幅升高。但對引發(fā)維管束間薄壁細(xì)胞自動(dòng)反分化時(shí)4種內(nèi)源激素的閾值還未能分析檢測，未來研究引發(fā)爬山虎自然生長于巖石壁上的木質(zhì)藤本莖木質(zhì)部中內(nèi)源激素升高的分子機(jī)制，將是厘清爬山虎自然生長莖自發(fā)產(chǎn)生不定根的有效方法，也為探索木本植物莖上自發(fā)產(chǎn)生不定根這一科學(xué)問題提供新思路。

4 結(jié)論

本研究以自然生長于巖石壁上的爬山虎木質(zhì)藤本莖自發(fā)產(chǎn)生不定根為研究目標(biāo)，觀察到一年生爬山虎自然生長不生根莖外施激素處理后其維管束間薄壁細(xì)胞反分化產(chǎn)生不定根原基（圖1～2），因此屬于內(nèi)起源。所檢測的4種內(nèi)源激素在自發(fā)生根的莖木質(zhì)部內(nèi)的濃度均明顯高于不生根的莖（圖7～10），且其IAA/CTK比值達(dá)到了27～76。對不產(chǎn)生不定根的一年生爬山虎莖進(jìn)行外施激素處理使其產(chǎn)生不定根，此時(shí)莖木質(zhì)部內(nèi)4種激素的濃度均有大幅增高，因此爬山虎自然生長的木質(zhì)莖自發(fā)產(chǎn)生不定根是在多種內(nèi)源激素協(xié)同作用下而產(chǎn)生的。提示依據(jù)根冠平衡理論，可通過技術(shù)手段促進(jìn)爬山虎生長莖上根系生長，來打破其攀援莖的生長高度限制，可更好的應(yīng)用于城市垂直綠化以及礦山高陡巖質(zhì)邊坡的生態(tài)修復(fù)。