郭丹峰，雷建剛，章澤恒（. 嘉實（湖南）醫(yī)藥科技有限公司，長沙 4027；2. 湖南省藥品審評認證與不良反應監(jiān)測中心，長沙 4003）

克林霉素磷酸酯為化學半合成的克林霉素衍生物，體外無抗菌活性，在堿性磷酸酯酶作用下迅速水解為克林霉素，進而表達藥理活性，其抗菌譜、抗菌活性及治療效果與克林霉素相同。克林霉素磷酸酯和克林霉素相比，具有更優(yōu)的脂溶性及滲透性，臨床應用更加廣泛[1-2]?？肆置顾亓姿狨プ⑸湟褐泄δ苄暂o料包括苯甲醇和依地酸二鈉，苯甲醇含量的限度和檢測方法已被《中國藥典》收錄[3]，依地酸二鈉限度和檢測方法未被收錄，也無文獻報道。

依地酸二鈉作為金屬離子螯合劑，可防止由原輔料、生產(chǎn)設備和包材引入的元素雜質(zhì)催化藥液發(fā)生氧化水解或生成絮狀沉淀，提高藥物的穩(wěn)定性[4-5]，但其濃度過高時可能引起血鈣濃度下降。為保證保障患者的用藥安全，應建立克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉含量檢測方法并對其含量進行有效控制。

1 材料

安捷倫1260 型高效液相色譜儀（Agilent Technologies Co. Ltd，USA）；梅特勒XS105DU型分析天平、梅特勒FE-28 型pH 計（METTLER TOLEDO，Switzerland）；Milli-Q 超純水儀（Merck KGaA，Germany）。

依地酸二鈉（批號：R028C1，純度以100%計，USP）；甲醇（色譜純，Sigma）；水為超純水；甲酸（分析純，國藥集團）；25%四丁基氫氧化銨（分析純，天津光復）；三氯化鐵（分析純，阿拉?。?；克林霉素磷酸酯注射液（批號：DP6232，輝瑞，規(guī)格為300 mg/2 mL，依地酸二鈉的處方含量為0.5 mg·mL－1；批號：20063021，與輝瑞處方和規(guī)格相同的自制品）；按照參比制劑處方配制不含依地酸二鈉的克林霉素磷酸酯注射液（批號：200615，自制）。

2 方法

2.1 色譜條件

照高效液相色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0512）測定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent Zorbax SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.006 mol·L－1的四丁基氫氧化銨溶液（取25%四丁基氫氧化銨溶液6 mL，加水至1000 mL，混勻，用甲酸調(diào)節(jié)pH 至3.5）為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫（0 ～15 min，75%A；15 ～30 min，75% ～20%A；30 ～31 min，20% ～75%A；31 ～40 min，75%A）；檢測波長為254 nm；柱溫為30℃；流速為1.0 mL·min－1，進樣量為20 μL。

2.2 溶劑的制備

取三氯化鐵適量，用超純水稀釋制成含三氯化鐵0.1 mg·mL－1的溶液，作為溶劑。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取依地酸二鈉適量，用超純水稀釋制成含依地酸二鈉100 μg·mL－1的溶液作為對照品儲備溶液。精密量取對照品儲備溶液適量，用溶劑稀釋制成含依地酸二鈉5 μg·mL－1的溶液，作為對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

精密量取供試品1 mL，用溶劑稀釋至100 mL，作為供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 專屬性試驗

精密量取不含依地酸二鈉的克林霉素磷酸酯注射液1 mL，用溶劑稀釋至100 mL，得陰性樣品溶液。取空白溶液（溶劑）、對照品溶液、陰性樣品溶液和供試品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果空白溶液及陰性樣品溶液對依地酸二鈉測定無干擾，依地酸二鈉峰形良好，見圖1。

圖1 克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of disodium edetate in clindamycin phosphate injection

3.2 檢測限和定量限考察

取對照品溶液適量，用溶劑稀釋成含不同濃度依地酸二鈉的溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，當信噪比（S/N）＝3 時，依地酸二鈉濃度為0.03 μg·mL－1，為檢測限；當S/N＝10 時，依地酸二鈉濃度為0.10 μg·mL－1，為定量限。

3.3 線性關系考察

精密量取對照品儲備溶液適量，用溶劑稀釋制成含依地酸二鈉0.10、0.50、1.01、3.02、5.04、6.05 μg·mL－1的系列標準溶液，分別進樣，以依地酸二鈉濃度為橫坐標，以對應峰面積為縱坐標，按最小二乘法計算線性回歸方程，即Y＝2.60×104X－1.32×103，r＝0.998，結(jié)果說明依地酸二鈉在0.10 ～6.05 μg·mL－1內(nèi)與峰面積線性關系良好。

3.4 精密度試驗

取“2.3”項下對照品溶液，重復進樣6 次，依地酸二鈉峰面積RSD為0.27%，說明儀器精密度良好。

3.5 重復性試驗

精密量取供試品（批號：20063021）1 mL，用溶劑稀釋至100 mL，作為供試品溶液，平行制備6 份，進樣測定，按外標法以峰面積計算，供試品中依地酸二鈉含量的平均值為0.49 mg·mL－1，RSD為0.21%，說明本方法具有良好的重復性。

3.6 溶液穩(wěn)定性試驗

取“2.3”項下對照品溶液和“2.4”項下供試品（批號：20063021）溶液，在室溫條件下保存，分別于0、4、8、16、24、48 h 進樣測定，記錄色譜圖中依地酸二鈉峰面積，結(jié)果對照品溶液中依地酸二鈉峰面積RSD為1.2%，供試品溶液中依地酸二鈉峰面積RSD為0.77%，表明對照品溶液和供試品溶液在室溫條件下48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 回收試驗

以依地酸二鈉理論濃度為基準100%，精密量取“2.3”項下對照品儲備液1、5、6 mL 分別置于100 mL 量瓶中，再分別加入不含依地酸二鈉的克林霉素磷酸酯注射液1 mL，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為20%、100%和120%的回收試驗溶液，各濃度平行配制3 份。精密量取上述回收率溶液，進樣測定，計算回收率。依地酸二鈉的回收率在98.4%～101.5%內(nèi)（n＝3），RSD為0.71%，表明本方法的回收率良好。

3.8 影響因素試驗

對克林霉素磷酸酯注射液（批號：20063021）和按處方自制的克林霉素磷酸酯注射液（批號：DP6232）開展影響因素試驗，除去注射液的外包裝以及標簽，考察高溫（60℃）和光照（光源強度5500 lux、近紫外燈能量85 μW·cm－2）對依地酸二鈉含量的影響。精密量取供試品1 mL，用溶劑稀釋至100 mL，作為影響因素試驗的供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件進樣，計算依地酸二鈉的含量，結(jié)果見表1。

表1 不同考察條件下樣品中依地酸二鈉含量測定結(jié)果Tab 1 Content determination of disodium edetate under different investigation conditions

4 討論

4.1 溶劑的選擇

依地酸二鈉易與金屬元素螯合，直接進樣依地酸二鈉時受色譜系統(tǒng)中金屬元素的影響主峰拖尾嚴重[6]。為改善主峰峰形，可先使依地酸二鈉與Fe3＋或Cu2＋離子形成穩(wěn)定的螯合物，再注入液相色譜系統(tǒng)。EDTA-Fe 螯合物與EDTA-Cu 螯合物相比，穩(wěn)定性更強，且所得色譜峰峰形更好，以EDTA-Fe 螯合物的形式檢測依地酸二鈉含量的方法更為常見[7-9]。當溶劑中三氯化鐵質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL－1（摩爾濃度為0.6 mmol·L－1），可保證對照品溶液和供試品溶液中5 μg·mL－1的依地酸二鈉（摩爾濃度為0.015 mmol·L－1）全部轉(zhuǎn)化為螯合物。

4.2 耐用性討論

當流動相A 的pH 值為3.3 ～3.7，柱溫為25 ～35 ℃，流速為0.8 ～1.2 mL·min－1，依地酸二鈉峰形無明顯變化，且苯甲醇、克林霉素磷酸酯及其有關物質(zhì)對依地酸二鈉檢測無干擾，含量檢測結(jié)果與擬訂的色譜條件一致，說明本方法具有良好的耐用性。待依地酸二鈉出峰后，流動相中有機相比例逐漸升高至80%，確保供試品溶液中所有組分均被洗脫出色譜系統(tǒng)，防止殘留在色譜柱中影響后續(xù)樣品檢測。

4.3 影響因素試驗結(jié)果討論

輝瑞和自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉的初始含量均為0.5 mg·mL－1，與處方量一致，換算成百分濃度為0.05%，在靜脈給藥輸液中的參考用量0.01%～0.075%[10]。高溫條件下，依地酸二鈉含量均無變化，預測在規(guī)定的貯藏條件下（遮光、密閉、陰涼），輝瑞和自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉含量均不會發(fā)生改變。光照條件下，依地酸二鈉含量均有所下降，但自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉含量降低速度更快。有文獻報道了元素雜質(zhì)在光照條件下催化依地酸二鈉降解[11-12]，因此推測自制的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉含量降低速度更快與自制藥液中元素雜質(zhì)的含量更高有關，有待進一步證實。

本文建立的克林霉素磷酸酯注射液中依地酸二鈉含量檢測方法方法學驗證表明該方法具有較好的專屬性、重復性、準確性等，同時該方法操作簡便，適用于實驗室的日常放行檢測。