孫杰，張冰衛(wèi)，徐光富，李博*（. 南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京 98；. 中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 0009；3. 中國藥科大學(xué)理學(xué)院，南京 98）

殼聚糖（chitosan）是氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖組成的多糖，它是天然糖類中唯一大量存在的堿性氨基多糖[1-2]。目前殼聚糖已經(jīng)被應(yīng)用于食品、藥用輔料、生物醫(yī)學(xué)材料等多個(gè)領(lǐng)域，在緩控釋制劑、生物醫(yī)學(xué)材料等方面扮演著越來越重要的角色[3-6]。

萘普生（naproxen）是非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥，通過抑制前列腺素合成而起到抗炎鎮(zhèn)痛作用[7]。近年來已有利用殼聚糖等對萘普生進(jìn)行包封[8-9]，開發(fā)緩控釋制劑等的報(bào)道，以改善萘普生的吸收及降低其不良反應(yīng)。在制劑中，輔料與藥物之間可能通過靜電力、范德華力、疏水性作用力、氫鍵作用力等形成包合物、共晶、分散體、復(fù)合物等，因此在藥物制劑研發(fā)過程中，對藥物與輔料間相互作用的考察不可缺少[10]。熱分析法、紅外光譜法、X 衍射法等是常用的藥物與輔料相互作用研究方法[11]。

熒光光譜法常用于蛋白質(zhì)和小分子之間相互作用的研究，利用小分子對蛋白質(zhì)熒光猝滅，通過Stem-Volmer 方程計(jì)算熒光猝滅常數(shù)Ksv，并計(jì)算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔS 和ΔG，研究結(jié)合常數(shù)和作用力類型[12]。課題組前期對大分子猝滅劑與小分子熒光物之間的相互作用模型進(jìn)行了完善，比較了小分子熒光藥物與大分子之間相互作用研究模型[13]。本文利用熒光光譜法研究萘普生和殼聚糖之間相互作用的結(jié)合常數(shù)，推測殼聚糖與萘普生作用的基本原理，從而為殼聚糖與藥物的相互作用的研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，也為殼聚糖作為輔料的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料

F4600 熒光分光光度計(jì)（日本日立）；2004-21 智能型超級恒溫水槽（常州國華電器有限公司）；pH 計(jì)（pHS-3B，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。萘普生（含量：99.9%，批號：100198-201004，中國食品藥品檢定研究院），殼聚糖（4 ～296 kD，中國藥科大學(xué)藥劑教研室；410 kD，江南大學(xué)），其他試劑為分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 萘普生溶液（NPS） 稱取10 mg 萘普生于10 mL 的量瓶中，甲醇溶解并定容，得萘溶液濃度為1.74×10－4mol·L－1的NPS 溶液，于4℃保存。

2.1.2 殼聚糖溶液（CTS） 稱取0.25 mg 殼聚糖于25 mL 量瓶中，水溶解并定容，得濃度為2.44×10－7mol·L－1的CTS 溶液，于4℃保存。

2.1.3 Britton-Robinson（BR）緩沖液 取0.04 mol·L－1的磷酸、乙酸、硼酸混合酸液，用0.2 mol·L－1氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至5。

2.2 激發(fā)波長和發(fā)射波長的確定

移取0.1 mL 的NPS 溶液于5 mL 量瓶中，加1.5 mL BR 緩沖液，用水定容，置1 cm×1 cm 的石英比色皿中，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，確定最大激發(fā)波長（262 nm）和發(fā)射波長[（355±0.5）nm]。熒光激發(fā)和發(fā)射波長狹縫寬度皆為5 nm，掃描速度為1200 nm·min－1，掃描電壓為400 V。

2.3 熒光光譜分析

在5 mL 量瓶中，依次加入0.1 mL NPS 溶液、1.5 mL BR 緩沖液，用水定容，搖勻，298 K（25℃）恒溫水浴10 min，固定激發(fā)波長262 nm，在250 ～ 450 nm 掃描NPS 的熒光光譜圖。

在5 mL 量瓶中，依次加入0.1 mL NPS 溶液、1.5 mL BR 緩沖液和不同體積的CTS 溶液，用水定容，搖勻，配制系列NPS 和CTS 混合溶液。將該混合溶液置298 K（25℃）恒溫水浴10 min，固定激發(fā)波長262 nm，在250 ～450 nm 內(nèi)分別掃描復(fù)合物的熒光光譜圖，記錄各溶液的熒光強(qiáng)度。

2.4 結(jié)合常數(shù)測定

根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線（公式1），以NPS 溶液355 nm 處熒光強(qiáng)度為F0，NPS 和CTS 混合溶液的355 nm 處熒光強(qiáng)度為F，將CTS濃度[Q]對熒光猝滅與F0/F進(jìn)行線性回歸，計(jì)算CTS 與NPS 的相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光光譜特征

如圖1 所示，NPS 的熒光發(fā)射波長和激發(fā)波長分別為355 nm 和262 nm。因此后續(xù)試驗(yàn)中，分別以355 nm 和262 nm 為熒光發(fā)射波長和激發(fā)波長。

圖1 萘普生的熒光激發(fā)光譜圖和發(fā)射光譜圖Fig 1 Fluorescence excitation and emission spectrogram of NPS

3.2 體系pH 值對熒光猝滅的影響

分別在pH 4、5、6、7、8、9、10 的條件下測定NPS 溶液（1.74×10－4mol·L－1）、CTS 溶液（2.44×10－7mol·L－1）、NPS-CTS 結(jié)合物的熒光強(qiáng)度值。結(jié)果如圖2 所示，CTS 在各個(gè)pH值下熒光強(qiáng)度均很弱，與NPS 的熒光強(qiáng)度相比，可以忽略不計(jì)；NPS 的熒光強(qiáng)度隨著pH 值的變化沒有明顯的變化。

圖2 pH 值對熒光猝滅的影響Fig 2 Influence of pH on fluorescence quenching

當(dāng)pH 值為5 時(shí)，NPS-CTS 的熒光強(qiáng)度最弱，此時(shí)pH 值條件下CTS 對NPS 的熒光猝滅程度最大，而對于NPS 和CTS 自身的熒光強(qiáng)度沒有明顯的影響。因此選擇與NPS 的pKa值相近的pH 5為測定的pH 值。由圖3 得出，在pH 5 時(shí)，NPS和CTS 相互作用的結(jié)合常數(shù)相對最大。

圖3 pH 值對結(jié)合常數(shù)的影響Fig 3 Influence of pH on binding constants

3.3 緩沖液的用量對熒光猝滅的影響

確定BR 緩沖液的pH 值為5.0，考察NPS、CTS、NPS-CTS 在不同用量緩沖液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL）條件下熒光強(qiáng)度值的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)緩沖液用量對熒光強(qiáng)度的影響不大，綜合選擇1.5 mL 作為試驗(yàn)條件。

3.4 水浴時(shí)間的考察

確定緩沖液的pH 為5.0，用量為1.5 mL，取NPS 0.7 mL，加BR 緩沖液10.5 mL，加CTS 0.7 mL，用純凈水補(bǔ)足至35 mL，在25 ℃恒溫水浴中水浴加熱，于0 ～67 min 時(shí)間點(diǎn)取樣測定熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示在0 ～67 min 內(nèi)，體系猝滅程度基本不變，復(fù)合物在測定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定，綜合選擇水浴時(shí)間為10 min。

3.5 熒光猝滅類型

熒光猝滅分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種，動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞等導(dǎo)致的猝滅，而靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光分子在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)光的復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。在研究分子間相互作用，計(jì)算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)時(shí)，靜態(tài)猝滅是關(guān)鍵的前提條件。所以首先要對其猝滅類型進(jìn)行判斷。試驗(yàn)考察了不同溫度對NPS 和CTS 相互作用情況的影響。圖4 為NPS 在288、298 和303 K 與CTS 相互作用的Stem-Volmer（公式2）曲線圖，表1 為各溫度計(jì)算的Ksv。

圖4 不同溫度下NPS 與CTS 相互作用的Stem-Volmer 曲線圖Fig 4 Stem-Volmer curve of interaction between NPS and CTS

表1 不同溫度下CTS-NPS 的Ksv 常數(shù)Tab 1 Ksv of CTS-NPS at different temperatures

如圖4 和表1 所示，各溫度下Stem-Volmer曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r＞0.99），隨著溫度的升高，Stem-Volmer 曲線圖斜率下降，Ksv常數(shù)不斷變小，這是因?yàn)閷τ陟o態(tài)猝滅在溫度升高時(shí)可能引起復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，從而減小了靜態(tài)猝滅的程度，因此可以判斷本文研究猝滅屬于靜態(tài)猝滅。在實(shí)際操作過程中，為了避免溫度太高使得分子熱運(yùn)動(dòng)加劇從而導(dǎo)致體系在靜態(tài)猝滅的同時(shí)發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅，同時(shí)為了試驗(yàn)的易于進(jìn)行，最終選擇298 K 作為試驗(yàn)條件。

3.6 結(jié)合常數(shù)測定

取1.74×10－4mol·L－1NPS 溶液，加入不同濃度的CTS，加1.5 mL BR 緩沖液，用水定容到5 mL。激發(fā)波長262 nm，于200 ～500 nm 內(nèi)掃描得到萘普生的熒光猝滅光譜（見圖5）。

圖5 298 K 時(shí)不同濃度CTS 對萘普生的熒光猝滅光譜圖Fig 5 Fluorescence quenching of NPS with series concentration of CTS at 298 K

如圖5 的猝滅曲線所示，不同濃度CTS-NPS溶液的最大發(fā)射波長均為355 nm，表明CTS 能夠與NPS 發(fā)生相互作用進(jìn)而猝滅NPS 的熒光。以355 nm 處的熒光強(qiáng)度，按Lineweaver-Burk 曲線進(jìn)行線性回歸，得到圖6 的回歸曲線圖，以截距與斜率的比值計(jì)算Ka，得到CTS 與NPS 的結(jié)合常數(shù)Ka為8.29×105L·mol－1；按公式（3）對雙對數(shù)曲線進(jìn)行線性回歸，得到圖7 的回歸曲線圖，其斜率為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，得CTS 與NPS 的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.12，可見 CTS 與NPS 基本上是1∶1 結(jié)合的。

圖6 NPS 和CTS 相互作用的Lineweaver-Burk 曲線圖Fig 6 Lineweaver-Burk curve of NPS and CTS

圖7 NPS 和CTS 相互作用的雙對數(shù)曲線圖Fig 7 Double logarithmic curve of MET and CTS

3.7 作用力的推測

由不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Ka， 通過Arrhenius 方程計(jì)算殼聚糖與萘普生相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 殼聚糖與萘普生相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Tab 2 Thermodynamic parameter of reaction between NPS and CTS

從表2 中可以看到，NPS 與CTS 相互作用的ΔH ＜0，ΔS ＞0。由于ΔS ＞0 可能是疏水和靜電作用力，ΔH ＜0 且較小時(shí)為靜電作用力，因此CTS 和NPS 之間的作用力主要為靜電作用力。又因?yàn)棣 對ΔG 的貢獻(xiàn)比ΔH 大，所以還含有疏水作用。表明作用力主要是CTS 的-NH3＋與NPS 的-COO－以靜電力結(jié)合，1∶1 作用形成分子量較大的復(fù)合物而使NPS 的熒光變?nèi)?。同時(shí)兩者反應(yīng)的自由能ΔG ＜0，表明反應(yīng)在正方向上是自發(fā)進(jìn)行的。

3.8 殼聚糖分子量對相互作用的影響

分別考察了分子量為4、6、8、10、30、50、100、240、296、410 kD 的CTS 與NPS 的相互作用，結(jié)果如表3 所示，隨著殼聚糖分子量（MW）的逐漸增大，CTS 與NPS 的結(jié)合常數(shù)線性增大，回歸方程Ka＝2.165 MW－155.5，相關(guān)系數(shù)r為0.9900；同時(shí)結(jié)合仍為1∶1 結(jié)合。

表3 不同分子量殼聚糖與萘普生的相互作用Tab 3 Interaction of CTS with different weight and NPS

3.9 殼聚糖脫乙酰度對相互作用的影響

分別比較對脫乙酰度74.4%～88.8%的CTS與NPS 的相互作用，結(jié)果見表4。

表4 脫乙酰度對殼聚糖與萘普生相互作用的影響Tab 4 Effect of degree of deacetylation on the interaction of CTS and NPS

如表4 所示，CTS 的脫乙酰度（DD）對結(jié)合常數(shù)影響非常顯著，脫乙酰度與結(jié)合常數(shù)的回歸方程為Ka＝7.370×104DD－5.263×106，相關(guān)系數(shù)為0.9926。結(jié)合位點(diǎn)數(shù)除了脫乙酰度為82.9%的點(diǎn)其他沒有明顯改變，仍為1∶1 結(jié)合。在脫乙酰度為74.4%的較低的脫乙酰度的情況下，CTS對NPS 產(chǎn)生的熒光猝滅極弱，且隨著CTS 濃度的增加沒有呈現(xiàn)熒光猝滅增強(qiáng)的規(guī)律，說明當(dāng)CTS的脫乙酰度較低，游離的-NH2數(shù)較少時(shí)，其與NPS 的作用很弱，導(dǎo)致NPS 的熒光沒有明顯的被猝滅現(xiàn)象，從也無法準(zhǔn)確計(jì)算其結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；當(dāng)CTS 的脫乙酰度逐漸增加時(shí)，游離的-NH2數(shù)逐漸增多，其與NPS 的相互作用增強(qiáng)，熒光猝滅現(xiàn)象明顯。由此可見，NPS 與CTS 的相互作用主要是靜電作用，CTS 的脫乙酰度對其與NPS 的相互作用影響較大，且CTS-NPS 結(jié)合的Ka值與脫乙酰度呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.9926。

4 結(jié)論

本文利用熒光光譜法證實(shí)NPS 與CTS 可發(fā)生相互作用，在pH 5.0、溫度298 K 時(shí)，兩者的結(jié)合比例為1∶1，結(jié)合常數(shù)為8.29×105L·mol－1；其相互作用以靜電作用為主。同時(shí)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CTS的分子量和脫乙酰度與其和NPS 的結(jié)合常數(shù)成正比，且脫乙酰度影響更為顯著，表明兩者的靜電作用通過CTS 的氨基發(fā)生；而結(jié)合比例基本不受CTS 的分子量和脫乙酰度影響。本研究為CTSNPS 等復(fù)合物的制備及CTS 作為藥物緩控釋材料的研究提供基礎(chǔ)。