楊炳治，楊旭娟，黃茜，曹亞茹，劉國光，劉一丹*（1. 麗江文化旅游學院，云南 麗江 674100；.昆藥集團股份有限公司藥物研究院，昆明 650100）

中藥注射劑是我國特有的中藥劑型，已有幾十年的發(fā)展歷史。隨著科技進步，中藥注射劑作為現(xiàn)代中藥劑型的發(fā)展方向之一，已廣泛應用于危重疾病急救及感染性疾病、心腦血管疾病和惡性腫瘤等的治療，在保障人類健康中發(fā)揮著重要作用[1]。然而，中藥注射劑通常是由多種藥材組成的復方，每味中藥成分復雜多樣，部分中藥藥效物質(zhì)基礎還未明確。此外中藥材的質(zhì)量受產(chǎn)地、采收季節(jié)影響較大，因產(chǎn)地、生長環(huán)境、采摘時間、存放時間長短不同等，導致同種藥材的有效或有毒成分含量不同[2]，容易出現(xiàn)安全隱患。劉爽等[3]報道的文獻中，整理了2010—2015年各年度國家藥品不良反應監(jiān)測通報的中藥注射劑排名情況，可見排名始終位居前列的有清開靈注射液、參麥注射液、雙黃連注射液。易艷等[4]報道的文獻中，不良反應報道較多的3 種中藥注射劑，分別為魚腥草注射液、生脈注射液和清開靈注射液，結(jié)果顯示臨床1.5 倍和3.3 倍濃度的生脈注射液和清開靈注射液均可以引發(fā)小鼠發(fā)生以血管通透性增高為主要表現(xiàn)的輕微類過敏反應，并且呈現(xiàn)一定的量效關系。因此陽性對照物除了化合物Compound48/80（C48/80）還增加了清開靈注射液。

注射用曲札茋苷是從拉薩大黃藥材乙醇提取物中分離、純化得到，具有抗氧化、抗炎、抗神經(jīng)細胞凋亡作用；能縮小缺血再灌注引起的腦梗死面積、減輕腦水腫，能改善腦卒中動物的行為學障礙、促進神經(jīng)缺失癥狀的恢復。注射用曲札茋苷是昆藥集團獨創(chuàng)的一類創(chuàng)新藥，目前已獲得臨床批件（No.2018L02062）。本文旨在建立RBL-2H3 細胞脫顆粒體外類過敏檢測體系，對中藥注射劑安全性進行快速初步評價，再結(jié)合小鼠體內(nèi)類過敏檢測體系進行綜合分析，為企業(yè)中藥注射劑類過敏反應做出及早預警和消除隱患提供一定技術手段，同時為企業(yè)注射劑再評價工作奠定基礎。

1 材料

1.1 試藥

注射用曲札茋苷（昆藥集團藥物研究院，批號：170101，規(guī)格：20 mg/瓶）；C48/80（Sigma 公司，批號：Lot#056M4067V，－20℃保存）；清開靈注射液（吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，批號：17011604，規(guī)格：2 mL/支）。伊文思藍（EB，上海源葉生物科技有限公司，批號：M26S6L3294）；甲酰胺（生工生物工程股份有限公司，批號：CB18BA0025）；MEM 培養(yǎng)基（HyClone 公司，批號：AC11016265）；胎牛血清（Gibco 公司，批號：1778586）；青-鏈霉素（BI 公司，批號：1731651）；PBS 緩沖液（Biosharp 公司，批號：67035331）；曲拉通X-100（TritonX-100，批號：20161121，規(guī)格：500 mL/瓶）；氯化鈉注射液（浙江國鏡藥業(yè)有限公司，批號：A170525A1）；ELISA 試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號：201801）；噻唑藍（MTT，Aladdin 公司，批號：A1720090）；二甲基亞砜（DMSO，批號：BCBH5215V，Sigma 公司）。

1.2 細胞株和實驗動物

大鼠嗜堿性白血病細胞株（RBL-2H3，廣州吉妮歐生物科技有限公司）。SPF 級雄性ICR 小鼠，體質(zhì)量18 ～22 g [昆藥集團動物室，生產(chǎn)許可證：SCXK（滇）K2014-0001]。SPF 級雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量18 ～22 g [昆明醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證：SCXK（滇）K2015-0002]。飼養(yǎng)于IVC 動物室，溫度20 ～25℃，濕度40%～70%，12 h 明暗交替，適應性飼養(yǎng)2 d 進入實驗。

1.3 儀器

PowerWaveXS2 全波長酶標儀（BioTek，Gene Company Limited）；XK96-A 快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；Milli-Q 超純水機（Merch Millipore 德國）；SYNERGY HT 多功能酶標儀（BioTex 公司）；XD-202 倒置顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（Themo 公司）；STS-3脫色搖床（上海琪特分析儀器有限公司）；96 孔無菌細胞培養(yǎng)板（Gibco 公司）；各系列量程手動移液器及離心管、不同規(guī)格Tip 頭（Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 體外檢測方法建立

2.1.1 細胞活力的測定[5-6]將對數(shù)期的細胞配制成細胞懸液，按接種密度分為4 組：0.5×104、1×104、2×104、2.5×104個/孔，分別于0、6、12、24、36、48、60 h 取樣檢測細胞活力，分別于對應時間點前4 h 給予MTT 液，50 μL/孔，并補足培養(yǎng)液至200 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去上清液，加入DMSO（200 μL/孔）震蕩溶解5 min，于570 nm 處測定吸光度（OD）。

2.1.2β-氨基己糖苷酶釋放率的測定 取對數(shù)期RBL-2H3 細胞，加入96 孔板隨機分為陰性對照組（氯化鈉注射液）、陽性對照組（C48/80 40 μg·mL－1或清開靈注射液1/32 原液、1/64 原液、1/128 原液）、注射用曲札茋苷組（200、100、50 μg·mL－1），每個濃度3 個復孔，每孔250 μL，培養(yǎng)1 h 后，取上清液，4℃、4000 r·min－1離心20 min，收集上清液；原細胞孔每孔加入250 μL 的0.1%TritonX-100，作用30 min，取上清液，4℃、4000 r·min－1離心20 min，收集上清液。在96 孔酶標板上，每孔加入β-氨基糖苷（7 mmol·L－1）50 μL，0.1%TritonX-100 5 μL， 各組上清液45 μL，37℃孵育90 min 后，每孔加入終止液NaCO3-NaHCO3150 μL，在405 nm 處使用酶標儀檢測光吸收A值；β-氨基己糖苷酶釋放率（%）＝[（各組上清樣品酶活性光吸收A值－調(diào)零孔光吸收A值）/（各組上清樣品酶活性光吸收A值＋各組細胞裂解孔光吸收A值－調(diào)零孔光吸收A值）]×100%。

2.1.3 組胺釋放率的測定 按ELISA 試劑盒說明，利用酶標儀分別測定待測的細胞上清和裂解后細胞上清的光吸收A值，計算藥物作用后細胞組胺釋放率。組胺釋放率（%）＝各組組胺上清釋放量/（各組組胺上清釋放量＋各組細胞裂解組組胺量）×100%。

2.2 注射用曲札茋苷體內(nèi)檢測類過敏反應

2.2.1 小鼠體內(nèi)檢測體系的建立[7]取60 只雄性ICR 小鼠，隨機分為陰性對照組（氯化鈉注射液）、陽性對照組[C48/80 1.25 mg·mL－1或相當于臨床劑量20 倍和10 倍的清開靈高、低劑量組（0.7、0.35 mL）]、相當于臨床劑量50 倍和30倍數(shù)的注射用曲札茋苷高、低劑量組（1.75、1.05 mg·mL－1）受試組，每組10 只。將含有0.8%伊文思藍（EB）指示劑與各給藥組按體積比1∶1進行配制，以20 mL·kg－1靜脈注射（iv）給藥。30 min 后，摘眼球取血，并分別用肝素抗凝管和普通離心管收集血液各約1 mL，放置2 h 后，3000 r·min－1離心5 min，收集上清液待測。脫頸椎處死小鼠，沿小鼠耳廓剪下耳朵，并記錄小鼠耳朵反應率[反應率（%）＝出現(xiàn)耳廓藍染的動物數(shù)/組內(nèi)動物數(shù)×100%]，剪碎小鼠耳朵，放入5 mL 的離心管中，加入2 mL/管甲酰胺浸泡48 h[8-9]。昆明種小鼠模型建立與ICR 小鼠相同。

2.2.2 伊文思藍滲出量及其升高率的計算 小鼠耳朵浸泡48 h 后，4000 r·min－1離心20 min，取上清液，加入96 孔酶標板中，每孔200 μL，酶標儀610 nm 處測定光吸收A值，并計算EB 滲出量（μg），EB 滲出升高率（%）＝（測試組EB 含量－對照組EB 含量）/對照組EB 含量×100%。

2.2.3 ELISA 法檢測動物血液中組胺、IgE 及VEGF 含量 離心所收集的血液、血漿和血清按ELISA 試劑盒說明分別測定組胺、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與免疫球蛋白（IgE），計算含量。

2.2.4 統(tǒng)計學方法 運用IBM SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較，采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD 方法比較，P≤0.05 時差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 體外實驗結(jié)果

3.1.1 RBL-2H3 細胞生長曲線 由于對數(shù)期細胞代謝最活躍，對外界刺激敏感性最強，是進行藥物影響實驗的最佳對象。根據(jù)圖1 的細胞生長曲線，可知接種密度為0.5×104個/孔在所選時間段內(nèi)一直處于對數(shù)生長期，因此細胞最佳種植密度為：0.5×104個/孔、作用時間為24 h。

圖1 RBL-2H3 細胞生長曲線Fig 1 RBL-2H3 cell growth curve

3.1.2β-氨基己糖苷酶和組胺釋放率 從表1 可以看出，與陰性對照組相比，C48/80、清開靈注射液1/32 原液組、1/64 原液組β-氨基己糖苷酶釋放率和組胺釋放率顯著升高（P＜0.01）；注射用曲札茋苷各劑量組差異均無統(tǒng)計學意義。

表1 細胞上清β-氨基己糖苷酶釋放率和組胺釋放率 ( ±s，n ＝3)Tab 1 Release rate and histamine release rate of cell supernatant β-aminoglycosidase ( ±s，n ＝3)

表1 細胞上清β-氨基己糖苷酶釋放率和組胺釋放率 ( ±s，n ＝3)Tab 1 Release rate and histamine release rate of cell supernatant β-aminoglycosidase ( ±s，n ＝3)

注：與陰性對照組相比，**P ≤0.01。Note：Compared with the negative control group，**P ≤0.01.

組別體系終濃度β-氨基己糖苷酶釋放率/%組胺釋放率/%陰性對照組－ 6.30±2.8358.80±2.78 C48/8040 μg·mL－119.16±1.50**70.84±5.64**清開靈注射液1/32 原液29.32±1.60**77.66±7.48**1/64 原液15.35±2.15**70.03±2.26**1/128 原液 8.81±1.0864.37±4.69注射用曲札茋苷 200 μg·mL－110.32±1.9263.89±3.50 100 μg·mL－1 9.99±1.5553.69±2.65 50 μg·mL－110.56±2.3349.36±7.34

3.2 體內(nèi)實驗結(jié)果

3.2.1 ICR 小鼠血管通透性情況 從表2 可以看出，與陰性對照組相比，C48/80 與相當于臨床劑量倍數(shù)20 倍和10 倍的清開靈高、低劑量組中EB 滲出量升高（P＜0.01）；相當于臨床劑量30倍和50 倍的注射用曲札茋苷組差異無統(tǒng)計學意義；其中C48/80、清開靈注射液高、低劑量EB升高率≥150%，類過敏較嚴重[10-11]。

表2 受試物誘導ICR 小鼠耳廓血管通透性增高反應(n ＝10)Tab 2 Increased auricle vascular permeability induced by test substance in ICR mice (n ＝10)

3.2.2 ELISA 試劑盒檢測ICR 小鼠相關因子 從表3 可以看出，與陰性對照組相比，C48/80、清開靈注射液高、低劑量組的VEGF 和組胺明顯升高（P＜0.01）；清開靈高、低劑量組的IgE 明顯降低（P＜0.01）；注射用曲札茋苷高、低劑量組IgE、VEGF、組胺差異均無統(tǒng)計學意義。

表3 ELISA 試劑盒測ICR 小鼠相關因子( ±s，n ＝10)Tab 3 Detection of related factors in ICR mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

表3 ELISA 試劑盒測ICR 小鼠相關因子( ±s，n ＝10)Tab 3 Detection of related factors in ICR mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

注：與陰性對照組相比，**P ≤0.01。Note：Compared with the negative control group，**P ≤0.01．

組別濃度IgE/（ng·mL－1）VEGF/（ng·mL－1）組胺/（ng·mL－1）陰性對照組（0.4%EB）－71.02±5.41 5.59±2.140.15±0.12 C48/801.25 mg·mL－161.67±12.5713.07±2.71**0.53±0.16**清開靈注射液0.7 mL50.96±6.07**11.05±2.07**0.55±0.14**0.35 mL48.55±16.64** 9.98±1.34**0.44±0.16**注射用曲札茋苷組1.75 mg·mL－159.78±12.04 6.25±1.070.25±0.09 1.05 mg·mL－157.23±14.64 7.62±0.580.24±0.09

3.2.3 ICR 小鼠耳朵藍染情況 ICR 小鼠耳朵藍染情況見圖2，C48/80 組反應率為100%；清開靈高、低劑量組反應率為80%。注射用曲札茋苷高劑量耳藍染動物數(shù)為3，反應率為30%，低劑量耳藍染動物數(shù)為2，反應率為20%。

圖2 ICR 小鼠耳朵藍染情況Fig 2 ICR mice the conditions of auricle blue staining

3.2.4 昆明種小鼠血管通透性情況 表4結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，C48/80 組與相當于臨床劑量倍數(shù)20 倍和10 倍的清開靈高、低劑量組EB 滲出量升高（P＜0.01）；相當于臨床劑量倍數(shù)50 倍和30倍的注射用曲札茋苷組差異無統(tǒng)計學意義。

表4 受試物誘導昆明種小鼠耳廓血管通透性增高反應(n ＝10)Tab 4 Increased auricle vascular permeability induced by test substance in Kunming mice (n ＝10)

3.2.5 ELISA 試劑盒檢測昆明種小鼠相關因子從表5 可以看出，與陰性對照組相比，清開靈高、低劑量組和注射用曲札茋苷高、低劑量組IgE 降低（P＜0.01）；C48/80 組、清開靈高、低劑量組組胺含量升高（P＜0.01）；C48/80 組、清開靈高、低劑量組VEGF 升高（P＜0.01，P＜0.05）；注射用曲札茋苷組高、低劑量組VEGF、組胺差異無統(tǒng)計學意義。

表5 ELISA 試劑盒測昆明種小鼠相關因子( ±s，n ＝10)Tab 5 Detection of related factors in Kunming mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

表5 ELISA 試劑盒測昆明種小鼠相關因子( ±s，n ＝10)Tab 5 Detection of related factors in Kunming mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

注：與陰性對照組相比，*P ≤0.05，**P ≤0.01。Note：Compared with the negative control group，*P ≤0.05，** P ≤0.01.

組別濃度IgE/（ng·mL－1）VEGF/（ng·mL－1）組胺/（ng·mL－1）陰性對照組（0.4%EB）－62.35±7.44 6.46±2.290.35±0.23 C48/801.25 mg·mL－152.50±10.2711.74±1.6**0.61±0.12**清開靈注射液0.7 mL41.88±18.92**10.22±1.5**0.63±0.13**0.35 mL39.29±10.35** 9.48±1.65*0.61±0.12**注射用曲札茋苷組1.75 mg·mL－141.45±7.59** 7.95±1.840.35±0.16 1.05 mg·mL－142.23±14.93** 5.59±2.070.25±0.09

3.2.6 昆明種小鼠耳朵藍染情況 昆明種小鼠耳朵藍染情況見圖3，C48/80 組反應率為100%，清開靈高劑量組反應率為100%，清開靈低劑量組反應率為90%；注射用曲札茋苷高、低劑量組反應率為0。

圖3 昆明種小鼠耳朵藍染情況Fig 3 Auricle blue staining in Kunming mice

4 討論

國家食品藥品監(jiān)督管理局要求注射用曲札茋苷申報臨床批件時要有更靈敏的過敏反應檢測方法，而目前國際上缺乏對類過敏檢測的統(tǒng)一方法，公認的有非免疫介導IgE、類過敏所致靶細胞脫顆粒機制、激活補體系統(tǒng)機制、激活激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)途徑、急性過敏途徑以及細胞骨架重排；體內(nèi)模型的建立主要依據(jù)的是非免疫介導IgE 機制與釋放炎癥介質(zhì)導致血管通透性增加；釋放炎癥介質(zhì)導致血管通透性增加從而引發(fā)類過敏反應的概念已比較成熟。與此同時非免疫介導IgE 機制還需進一步驗證，力爭有更為詳實的數(shù)據(jù)支持。

本研究通過試劑盒檢測 ICR 小鼠和昆明種小鼠的相關因子，發(fā)現(xiàn)C48/80 組的IgE 與陰性對照組相比沒有明顯差異；但在ICR 小鼠中，清開靈高、低劑量組IgE 與陰性對照組差異具有統(tǒng)計學意義；在昆明種小鼠中，清開靈和注射用曲札茋苷高、低劑量組IgE 與陰性對照組差異具有統(tǒng)計學意義；所有組別的IgE 與陰性對照組相比，都具有明顯的下降趨勢。為了進一步明確類過敏反應的作用趨勢，后期需要更多的數(shù)據(jù)進行驗證。

RBL-2H3 細胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的嗜堿性顆粒，當細胞發(fā)生類過敏反應時，會釋放組胺、β-氨基己糖苷酶等各類細胞因子[12-13]。其中組胺是經(jīng)典的過敏介質(zhì)，但檢測結(jié)果的穩(wěn)定和重復性較差，需要在短時間內(nèi)迅速完成實驗測定[14]。VEGF 亦被稱為血管通透因子，是一種分泌型多肽和強力內(nèi)皮細胞分裂劑。VEGF 能夠與血管內(nèi)皮細胞表面受體結(jié)合，產(chǎn)生一系列細胞信號級聯(lián)反應，從而導致微血管內(nèi)皮通透性增高[15-16]。C48/80 能夠激活G 蛋白，進而激活蛋白激酶C 和Ca2＋通道，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2＋進入細胞內(nèi)，肥大細胞和嗜堿性粒細胞內(nèi)的顆粒囊泡移向胞漿膜并釋放生物介質(zhì)，從而引發(fā)類過敏反應[17-18]。EB 是一種無明顯毒性的藍色染料，可迅速與血漿蛋白（主要為白蛋白）結(jié)合，形成蛋白結(jié)合物[19-20]。當血管通透性升高時，其可隨著血漿蛋白滲出到血管外的組織間隙中，造成組織明顯藍染，以反應率、EB滲出升高率為指標，定量定性分析樣品在小鼠體內(nèi)類過敏的反應程度[21]。

綜上所述，EB 滲出量與藥物劑量成正相關趨勢，且ICR 小鼠較為敏感，本研究通過對注射用曲札茋苷的初步評價可得其在該體內(nèi)外體系中不存在類過敏反應，安全性較高，這也對其用法用量提供一定的指導意義。