李佳茹，曹韻茗，楊郁鵬，司佳弘，趙季宇，任華山，金曉飛△，燕 平

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2.鄭州澎青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 鄭州 450064)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是一種常見的慢性持續(xù)性疾病，臨床上根據(jù)發(fā)病原因分為原發(fā)性骨關(guān)節(jié)病和繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)病[1]，原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎的病因目前沒有明確的探究與說明，發(fā)病人群多以老年人常見，繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎多是在已有的基礎(chǔ)上產(chǎn)生新的病理變化所致，由于各種炎癥的增生，膝關(guān)節(jié)內(nèi)部穩(wěn)定結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛腫脹等相關(guān)癥狀[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與膝關(guān)節(jié)周圍韌帶損傷有關(guān)，膝關(guān)節(jié)韌帶由致密的結(jié)締組織構(gòu)成，不僅可以控制關(guān)節(jié)滑動(dòng)，維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定，還可以保持關(guān)節(jié)面的生理壓力，減少摩擦，起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨作用[3]。本研究基于TGF-β1/Smads信號(hào)通路，以針刀刺激與電針“內(nèi)膝眼”“外膝眼”等作為對(duì)照，觀察KOA兔韌帶組織中TGF-β1、Smad4、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloprotein-9，MMP-9)mRNA及蛋白表達(dá)的影響，闡述針刀干預(yù)對(duì)KOA兔的作用機(jī)制及對(duì)韌帶組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步探討其作用與TGF-β1/Smads信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

日本大耳白兔32只，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(2.25±0.1)kg。由北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)提供[許可證號(hào)：SCXK-(京)2016-0007]，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為空白組、模型組、電針組和針刀組，每組8只。除空白組外，其余3組均造模。本研究經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；一次性無菌針刀、針灸針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；Smad4一抗(愛博泰克生物科技有限公司)；TGF-β1一抗(武漢博士德生物工程有限公司)；MMP-9一抗(武漢博士德生物工程有限公司)；顯微鏡(日本尼康株式會(huì)社)；凝膠成像分析儀(U-niversal HoodⅡ Bio-rad)；Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能生物科技有限公司)；移液器(美國(guó)Thermo公司)；熒光定量PCR儀(杭州博日科技有限公司)等。

1.3 KOA兔造模及干預(yù)措施

根據(jù)文獻(xiàn)[4]，采用改良的Videman法即左后肢伸直位固定制動(dòng)法造模，除空白組外，其余3組實(shí)驗(yàn)兔左下肢用石膏繃帶固定6周，結(jié)束后取各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織作病理觀察，顯示造模成功后進(jìn)行治療。1周后，空白組和模型組不做干預(yù)；電針組取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》兔腧穴定位[5]選取陰陵泉、陽陵泉、內(nèi)膝眼和外膝眼，選用0.18 mm×25 mm毫針直刺0.3 cm，以華佗牌電子針治療儀，分別連接陰陵泉和陽陵泉，內(nèi)膝眼和外膝眼。波形疏密波，頻率2/100 Hz，強(qiáng)度3 mA，每次20 min，以局部肌肉開始輕度抖動(dòng)、KOA兔不掙扎為度，隔日治療1次，1周治療3次，共治療3周；針刀組在兔膝關(guān)節(jié)針刀進(jìn)針部位，選用一次性無菌針刀，規(guī)格0.35 mm×30 mm，以龍膽紫定位，常規(guī)備皮、消毒，然后刺入針刀，出針并按壓片刻止血，每周1次，共3次，進(jìn)針點(diǎn)操作：針刀于內(nèi)、外韌帶中點(diǎn)前緣進(jìn)針，刀口線與韌帶平行，刀體與皮膚切面垂直刺入，向韌帶起止點(diǎn)方向分別松解，出刀并加壓片刻。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 組織形態(tài)觀察 各組兔用10%的水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉，取左側(cè)膝關(guān)節(jié)外側(cè)中斷韌帶組織，切成0.5 cm×0.3 cm×0.1 cm小塊，立即放置于4%多聚甲醛中固定48 h，EDTA 脫鈣完全后修切并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片，HE染色后光鏡下觀察。

1.4.2 關(guān)節(jié)腔內(nèi)狀態(tài)觀察 打開兔膝關(guān)節(jié)腔，肉眼大體觀察各組兔膝關(guān)節(jié)的滑膜、周圍韌帶、肌肉-肌腱和關(guān)節(jié)囊等大體形態(tài)表現(xiàn)。由兩位觀察者參照J(rèn)essicaBadendick評(píng)分系統(tǒng)[6]對(duì)各組兔大體形態(tài)進(jìn)行評(píng)分，要求兩名評(píng)分人員同時(shí)對(duì)樣本進(jìn)行評(píng)估并各自打分，結(jié)果取兩者平均值，兩次評(píng)估人員相同。見表1。

表1 JessicaBadendick大體形態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)檢測(cè)關(guān)節(jié)韌帶組織mRNA含量 分別提取各組兔膝關(guān)節(jié)韌帶組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA單鏈為模板，采用25 μLPCR反應(yīng)體系：各基因?qū)?yīng)上下游引物各2.0 μL，qPCR Mix 12.5 μL，cDNA模板2.0 μL,滅菌雙蒸水8.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，35個(gè)循環(huán)；65 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，預(yù)變性95 ℃ 1 min，循環(huán)(40次)，95 ℃ 15 s→58 ℃ 20 s→72 ℃ 20 s末段延伸，72 ℃ 5 min，溶解曲線，72 ℃→95 ℃，每20 s升溫1 ℃選取GAPDH為內(nèi)參基因。采用2-△△CT表示各基因的相對(duì)表達(dá)量。見表2。

表2 引物序列

1.4.4 免疫印跡法(Western Blot，WB)法檢測(cè)關(guān)節(jié)韌帶組織蛋白含量 將凍存于-80 ℃冰箱的韌帶組織取出備用，使用RIPA裂解液將細(xì)胞裂解，按說明書步驟配制總蛋白溶液，置于組織勻漿器中，12 000 rpm離心5 min，取上清，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入TGF-β1一抗(1∶1 000)、Smad4一抗(1∶1 000)、MMP-9一抗(1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶2 000)，4 ℃搖床過夜，PBST洗膜，加二抗(1∶5 000)，4 ℃搖床過夜，PBST洗膜，ECL發(fā)光試劑盒顯色、顯影，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，用Image J軟件分析各條帶的灰度值，采用目標(biāo)蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值來表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 韌帶組織形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示：空白組膝關(guān)節(jié)韌帶組織結(jié)構(gòu)完整，韌帶細(xì)胞數(shù)目多，排列整齊；模型組韌帶組織結(jié)構(gòu)層次不清，韌帶層薄而粗糙，韌帶細(xì)胞數(shù)目少，排列散亂；電針組與模型組比較，韌帶組織結(jié)構(gòu)層次清楚，韌帶細(xì)胞增多，但局部細(xì)胞排列散亂；針刀組與模型組比較韌帶組織結(jié)構(gòu)完整，韌帶細(xì)胞較多，排列整齊，但不及空白組。見圖1。

圖1 各組兔膝關(guān)節(jié)韌帶HE染色情況(200×)

2.2 關(guān)節(jié)腔內(nèi)狀態(tài)觀察

JessicaBadendick評(píng)分結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組關(guān)節(jié)腔軟骨形態(tài)評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，電針組、針刀組關(guān)節(jié)腔軟骨形態(tài)評(píng)分降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與電針組比較，針刀組評(píng)分較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組JessicaBadendick評(píng)分比較

2.3 各組KOA兔韌帶TGF-β1、Smad4及MMP-9 mRNA 表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組兔韌帶組織中TGF-β1、Smad4 mRNA表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，MMP-9 mRNA表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，電針組、針刀組TGF-β1、Smad4 mRNA表達(dá)較模型組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MMP-9 mRNA表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；針刀組與電針組比較，TGF-β1 mRNA表達(dá)較高，MMP-9表達(dá)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Smad4表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各引物擴(kuò)增曲線均正常，溶解曲線均單峰，見表4、圖2。

圖2 引物驗(yàn)證

表4 各組兔韌帶TGF-β1、Smad4和MMP-9 mRNA比較

2.4 各組KOA兔韌帶TGF-β1、Smad4及MMP-9蛋白表達(dá)的比較

與空白組比較，模型組兔韌帶組織中 TGF-β1、Smad4蛋白表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，電針組、針刀組TGF-β1、Smad4蛋白表達(dá)較模型組均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MMP-9蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；針刀組與電針組比較TGF-β1蛋白表達(dá)較高，MMP-9蛋白表達(dá)較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Smad4蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表5。

表5 各組兔韌帶TGF-β1、Smad4和MMP-9蛋白比較

圖3 各組TGF-β1、Smad4及MMP-9的Western Blot檢測(cè)結(jié)果

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為KOA形成的內(nèi)部原因主要與肝、腎相關(guān)，肝腎陰陽失調(diào)、氣血虧虛，正氣不足、邪氣內(nèi)生而引起骨性病變，外因可受風(fēng)寒濕熱等邪氣導(dǎo)致瘀血內(nèi)阻、筋脈不通和筋失濡養(yǎng)而致，臨床治療時(shí)多以補(bǔ)肝腎調(diào)氣血為主。但KOA的病因與發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，需要不斷的探索與研究，從韌帶分子生物學(xué)來看，其病理學(xué)特征是韌帶及周圍軟組織粘連損傷、攣縮等導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)無法發(fā)揮正常的生理活動(dòng)。前期研究結(jié)果顯示，針刀干預(yù)對(duì)KOA韌帶生物力學(xué)有影響[7]，調(diào)控該力學(xué)特性的分子生物學(xué)機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來論證。本實(shí)驗(yàn)在分子生物學(xué)理論的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究針刀治療KOA的作用效應(yīng)，其針刀的干預(yù)優(yōu)勢(shì)是對(duì)膝關(guān)節(jié)周圍韌帶組織進(jìn)行松解，抑制外源性愈合所導(dǎo)致的粘連，消除內(nèi)源性愈合的不利因素[8]，達(dá)到治愈的目的。其中，TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在內(nèi)源性愈合和外源性愈合起著非常重要的作用。

TGF-β1作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，在細(xì)胞增殖分化、凋亡、粘連和遷移等多個(gè)細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，它還是重要的致纖維化的細(xì)胞因子，有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、組織修復(fù)、參與炎癥和免疫等作用[9-10]。Smad4在信號(hào)傳輸途徑中處于中樞地位, 是唯一的共同介導(dǎo)型Smad[11]，Smad4蛋白的異常表達(dá)可引發(fā)TGF-β1蛋白表達(dá)的減少，導(dǎo)致周圍韌帶及軟組織的粘連[12]。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，作為TGF-β1/Smads信號(hào)通路的重要下游分子，過度表達(dá)會(huì)造成韌帶組織的破壞進(jìn)而導(dǎo)致KOA的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，當(dāng)阻斷TGF-β1/Smads信號(hào)通路在細(xì)胞核內(nèi)的傳遞作用，其能夠刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生，可以增加MMPs抑制劑的產(chǎn)生，阻止細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解，防止周圍組織粘連而產(chǎn)生瘢痕[14]，因此，可以通過抑制MMP-9的活性，促進(jìn)膠原及蛋白多糖等基質(zhì)合成，緩解軟骨退變，同時(shí)減少周圍組織粘連的增生，促進(jìn)膝骨關(guān)節(jié)炎愈合。

針刀是朱漢章教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)將傳統(tǒng)針具與現(xiàn)代醫(yī)療刀具結(jié)合的產(chǎn)物，在治療膝骨關(guān)節(jié)炎等方面發(fā)揮了重要的作用，針刀醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為[15-16]，針刀通過刺激病變的經(jīng)筋，松解周圍組織的粘連，使攣縮筋結(jié)的部分疏通，改善周圍軟組織的炎性病變，調(diào)節(jié)髕骨周圍產(chǎn)生的壓力及髕韌帶、交叉韌帶等力學(xué)平衡，加強(qiáng)筋肉的生理調(diào)節(jié)作用，恢復(fù)骨關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡，阻斷膝骨關(guān)節(jié)疾病的進(jìn)一步發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過研究針刀及電針干預(yù)下治療膝骨關(guān)節(jié)炎，對(duì)兔膝關(guān)節(jié)韌帶組織HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組膝關(guān)節(jié)韌帶的破壞程度最為嚴(yán)重，治療組經(jīng)針刀及電針治療后略有改善，既可證明造模成功，又提示針刀及電針治療的有效性，造模后膝關(guān)節(jié)韌帶組織TGF-β1、Smad4 mRNA和蛋白表達(dá)減弱，MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，韌帶組織有所損壞，造成膝關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生。針刀、電針干預(yù)可以進(jìn)一步激活TGF-β1/Smad4信號(hào)通路，抑制MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)韌帶功能的修復(fù)，且針刀的干預(yù)效果較優(yōu)于電針干預(yù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，針刀干預(yù)通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號(hào)通路的表達(dá)，可以促進(jìn)關(guān)節(jié)韌帶的修復(fù)，減輕關(guān)節(jié)韌帶損傷。

綜上所述，針刀及電針通過對(duì)TGF-β1/Smads通路發(fā)揮調(diào)控作用，表明該治療手段可以間接抑制韌帶組織被破壞，通過調(diào)節(jié)TGF-β1、Smd4和MMP-9的分泌以保護(hù)受損的韌帶組織，進(jìn)而緩解病情進(jìn)展，改善預(yù)后。但還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究該治療手段對(duì)KOA的改善情況，可在細(xì)胞層面上探究針刀對(duì)KOA在其他相關(guān)信號(hào)通路中的影響作用，為針刀應(yīng)用于臨床治療骨關(guān)節(jié)炎提供更具體的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。