彭思靜， 高燕燕， 楊寧線， 李 林， 陽 嬌， 張明生

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025)

杜鵑蘭[Cremastraappendiculate(D.Don)Makino]為蘭科(Orchidaceae)杜鵑蘭屬(Cremastra)多年生草本植物，具根狀莖和假鱗莖[1]，其干燥假鱗莖又名山慈菇，用于治療上火引起的口鼻腫痛、肺熱引起的咳嗽、跌打損傷引起的筋骨傷痛及燒傷燙傷[2]，還可用于治療食道癌、淋巴腫瘤等疾病[3]，在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、降糖降壓治療上有較好的效果[4]，其化學(xué)成分如黃酮類、生物堿等均具有重要的藥用價(jià)值，為緊缺中藥材之一[5]。隨著山慈菇藥用成分的開發(fā)，市場需求增大，過度的采挖和生態(tài)環(huán)境破壞致其資源匱乏，又因其自然繁殖率極低，野生資源幾近枯竭，使其處于瀕危狀態(tài)。

自然條件下，杜鵑蘭結(jié)實(shí)率不到5%，本課題組前期通過人工輔助授粉可使其結(jié)實(shí)率提高到97.78%以上[6]；雖然成熟蒴果含有大量種子，但種子極難萌發(fā)，一方面因?yàn)榉N胚未成熟且缺乏胚乳[7-8]，另一方面，與熱帶地區(qū)的附生蘭相比，溫帶地區(qū)陸生蘭的種子萌發(fā)更為復(fù)雜，因?yàn)殛懮m的成熟種子通常有兩層堅(jiān)韌的種皮，即覆蓋胚胎的內(nèi)外種皮，其不透氣及不透水性可能導(dǎo)致種子萌發(fā)困難[9]；此外，隨著種子成熟，抑制物質(zhì)(如酚類化合物和脫落酸)的積累可誘導(dǎo)種胚的生理休眠[10-11]。有研究采用不同的方法來優(yōu)化蘭科種子的萌發(fā)，包括未成熟種子的培養(yǎng)[12]、液體懸浮培養(yǎng)[13]、添加植物生長調(diào)節(jié)劑，以及培養(yǎng)前對(duì)種子進(jìn)行不同預(yù)處理，如劃破種皮、KOH溶液浸種等，對(duì)蘭科種子萌發(fā)率往往有較大影響[14-15]。

目前，有關(guān)杜鵑蘭的研究主要集中在假鱗莖化學(xué)成分分析[16]、組培快繁[17]等方面，有關(guān)種子非共生萌發(fā)過程中各階段形態(tài)結(jié)構(gòu)變化鮮見報(bào)道。本研究采用種子非共生萌發(fā)，篩選種子最佳采收胚齡，觀察種子不同發(fā)育時(shí)期的外部形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，探究破除種皮抑制萌發(fā)的預(yù)處理方法，以期為構(gòu)建杜鵑蘭有效繁殖技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

不同胚齡的杜鵑蘭蒴果采自貴州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(26°27′55″N，106°39′21″E)，為人工授粉所得。果莢健康飽滿、未開裂。

1.2 方 法

1.2.1不同胚齡種子萌發(fā)率測定

收集不同胚齡(60，75，90，120，135 d)的蒴果各5個(gè)，消毒后將不同蒴果內(nèi)的種子(100～150粒)均勻撒播在萌發(fā)培養(yǎng)基(MS+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+75 g·L-1土豆泥+0.5 g·L-1活性炭+4 g·L-1瓊脂)上，培養(yǎng)基pH值為5.6。培養(yǎng)條件：(25±1)℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)長12 h·d-1。每個(gè)處理播種9瓶，3個(gè)重復(fù)。播種90 d后統(tǒng)計(jì)每瓶萌發(fā)率。

萌發(fā)率(%)=[(種胚突破種皮數(shù)+原球莖數(shù)+根狀莖數(shù))/接種的種子數(shù)]×100%[18]。

1.2.2形態(tài)學(xué)及解剖學(xué)觀察

將萌發(fā)過程中不同階段的組織材料置于Stemi 508體式顯微鏡和Hitachi S 4000 cFE-SEMs掃描電鏡下觀察并拍照，記錄種子發(fā)育各階段的形態(tài)變化特征及萌發(fā)情況。

不同階段的樣品用2.5%戊二醛和1.6%多聚甲醛固定液(pH=6.8)固定24 h。固定后，樣品通過乙醇系列梯度脫水，然后用Technovit 7100(德國Kulzer & Co., Germany)逐漸滲透，將樣本嵌入Technovit 7100中[19]。切片采用Laica RM 2016旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(8 μm厚)，用甲苯胺藍(lán)染色試劑盒(TBO,Sangon)進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)染色。中性樹膠封片，切片置于Olympus BX 53光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行解剖結(jié)構(gòu)觀察并拍照。

1.2.3NaClO對(duì)種子TTC染色和萌發(fā)率影響的測定

為了評(píng)估NaClO對(duì)種子萌發(fā)率的影響，采用3因素3水平L9(34)正交設(shè)計(jì)，通過控制NaClO濃度和處理時(shí)間，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TTC染液驗(yàn)證種子活力。置于光學(xué)顯微鏡下觀察。種子經(jīng)預(yù)處理后用無菌水漂洗3次進(jìn)行非共生萌發(fā)實(shí)驗(yàn)(培養(yǎng)條件及萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)同1.2.1)。

TTC染色率(%)=(視野內(nèi)染色數(shù)/視野內(nèi)種子總數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin軟件作圖，Microsoft Excel 2007軟件和SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Duncan氏法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收時(shí)間對(duì)杜鵑蘭種子萌發(fā)的影響

不同采收時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)率有明顯的影響，表1結(jié)果顯示，授粉后120 d時(shí)萌發(fā)率最高，達(dá)54.01%。在這一時(shí)期，種子含水量適中，呈黃白色絮狀，胚體具有較高生活力。135 d后種子含水量低，隨后蒴果裂開，種子被釋放，種子萌發(fā)率顯著降低(47.54%)，木質(zhì)素含量達(dá)最大值(315.37 mg·g-1)，大多數(shù)種子已變成淺棕色。在60 d時(shí)收集的種子播種后沒有萌發(fā)就大部分褐化，原因是種胚尚未發(fā)育完全，在培養(yǎng)基中無法吸水膨脹進(jìn)而停止發(fā)育。此外，胚齡60～75 d的蒴果瘦小，與胚齡較大的蒴果存在明顯差異，種子細(xì)小呈白色，含水量較高(85.3%)，緊貼于胎座組織而難以分散開充分吸收養(yǎng)分。杜鵑蘭種子成熟度對(duì)其萌發(fā)率有較大影響，授粉后120 d左右采收種子較為適宜。

表1 不同采收時(shí)間對(duì)種子質(zhì)量和萌發(fā)的影響

2.2 杜鵑蘭種子結(jié)構(gòu)及其非共生萌發(fā)過程的形態(tài)變化

杜鵑蘭種子細(xì)小呈紡錘形，黃白色，通過掃描電鏡觀察到種皮表面未附著任何物質(zhì)(圖2 A)，致密無間隙。種胚為尚未發(fā)育成胚的胚性細(xì)胞團(tuán)，不含胚乳。種皮細(xì)胞壁木質(zhì)化增厚且有縱橫交錯(cuò)的網(wǎng)狀條紋，使種胚不易吸收水分和交換氣體，抑制了種胚發(fā)育(圖2 B)。上述結(jié)果證明，杜鵑蘭種子之所以在自然環(huán)境下難以萌發(fā)，除了缺乏營養(yǎng)物質(zhì)外，還與種皮厚度、種皮細(xì)胞的疏密程度等自身結(jié)構(gòu)有關(guān)。將種子播種于MS培養(yǎng)基30 d后，種胚吸水膨脹變大(圖3 B)，并擠壓種皮，種皮被撕裂。45 d左右露出局部種胚(圖2 C、圖2 D)。種胚漸漸出現(xiàn)極性，在形成小球狀胚體時(shí)，能觀察到多數(shù)粘連有已破碎的種皮(圖2 F)。

觀察發(fā)現(xiàn)，種子非共生萌發(fā)初期形成的原球莖多呈橢球形。光照條件下，球狀體頂端細(xì)胞內(nèi)形成葉綠體，使原球莖從白色變?yōu)榫G色(圖3 D)。頂端分化出葉原基，綠色芽點(diǎn)在后期分化成子葉，此時(shí)杜鵑蘭種子由異養(yǎng)轉(zhuǎn)為自養(yǎng)(圖3 F)。原球莖分化出芽，呈匍匐生長(圖3 G)。用掃描電鏡觀察切面，可以看到大型類圓形薄壁細(xì)胞，內(nèi)含大量草酸鈣針晶束，未糊化淀粉粒呈圓形，充滿整個(gè)薄壁細(xì)胞(圖2 I)。但原球莖基部未發(fā)育成根，而是產(chǎn)生許多由表皮細(xì)胞發(fā)育而來的白色毛狀物(圖2 H)，這些突起的“假根”呈不規(guī)則的束狀分布(圖3 E)。發(fā)育較快的原球莖繼續(xù)培養(yǎng)，大量吸收養(yǎng)分并快速伸長形成根狀莖，莖端分生組織陸續(xù)分化出第一片葉和第二片葉，葉片逐漸舒展(圖3 G、圖3 H)。隨著杜鵑蘭葉片的生長伸長，與根狀莖之間形成一定的夾角，并在拐角處逐漸膨大形成假鱗莖，假鱗莖基部分化出不定根，更有利于吸收營養(yǎng)(圖3 I)。將帶有假鱗莖和生根的幼苗(圖3 J、圖3 K)經(jīng)馴化移栽到混有大量腐殖質(zhì)且排水良好的蛭石基質(zhì)中(圖3 L)，移栽后30 d生長旺盛，葉片伸長3 cm左右，有的還能長出1片新葉。經(jīng)過90 d的移植，幼苗成活率最高(80%)。

在非共生萌發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)有少量雙胚種子，2個(gè)胚在種子中的位置多數(shù)呈上下排列，大小相差不大。這種雙胚現(xiàn)象，是合子胚在發(fā)育過程中分裂成兩部分，每一部分又獨(dú)立發(fā)育成胚，所以種子萌發(fā)過程中有部分形成2個(gè)原球莖。有些原球莖有2個(gè)以上生長點(diǎn)，其中有一部分后期能發(fā)育成完整植株。有部分原球莖未產(chǎn)生葉綠體，停止發(fā)育后褐化。杜鵑蘭原球莖不僅可以直接形成幼苗，還可以通過形成叢生芽再分化出苗。杜鵑蘭種子發(fā)育途徑也不完全一致，一種是在胚未轉(zhuǎn)綠時(shí)就突破種皮，另一種是胚轉(zhuǎn)綠后再突破種皮，形成原球莖，而且同一瓶中生長狀態(tài)并不統(tǒng)一。

2.3 杜鵑蘭種胚發(fā)育過程的結(jié)構(gòu)變化與原球莖形成

種子發(fā)育120 d時(shí)具內(nèi)外種皮的球形胚，無胚乳，單細(xì)胞胚柄退化，外種皮由一層細(xì)胞組成，無內(nèi)含物，內(nèi)種皮致密薄膜狀。切片觀察種皮細(xì)胞木質(zhì)化加厚，細(xì)胞表層具紋理，采用TBO染色法，種皮內(nèi)外壁呈藍(lán)綠色，表明種皮壁中存在酚類化合物(圖4 A)。135 d時(shí)，種皮的細(xì)胞脫水變成薄薄的一層，緊貼種胚。成熟種胚具有極性，遠(yuǎn)離胚柄端表面一層細(xì)胞體積較小，呈不規(guī)則四邊形，胚柄端細(xì)胞數(shù)目較少，細(xì)胞體積大，胚體兩側(cè)細(xì)胞呈不規(guī)則的長方形，這一時(shí)期染色深，細(xì)胞質(zhì)濃厚，充滿大量的貯藏物質(zhì)(圖4 B)。培養(yǎng)30 d后，種胚吸水膨脹，胚胎迅速增大，細(xì)胞數(shù)量增加，導(dǎo)致種皮嚴(yán)重破裂，胚體前端出現(xiàn)極性(圖4 C)。此時(shí)細(xì)胞分裂快，細(xì)胞小而多，核大質(zhì)濃，逐漸成為具有分生組織特點(diǎn)的細(xì)胞群。然后種胚繼續(xù)生長，胚柄端細(xì)胞體積增大，但分裂較慢。當(dāng)胚柄細(xì)胞退化消失、胚體完全脫離種皮時(shí)形成原球莖(圖4 D)。胚體向一側(cè)慢慢傾斜，傾斜的胚體上方出現(xiàn)背嵴，從這個(gè)分生組織區(qū)繼續(xù)伸長，導(dǎo)致種胚具有明顯的背腹對(duì)稱。當(dāng)原球莖由白色轉(zhuǎn)成綠色時(shí)，切片可觀察到少量草酸鈣晶體，多位于莖端分生組織。頂端圓錐狀凸起遵循原套-原體學(xué)說，為具典型原套原體結(jié)構(gòu)的生長錐。原套為表面一層排列整齊、等徑的小細(xì)胞構(gòu)成，可以使莖尖表面積增大；原體位于被原套覆蓋的頂尖分生組織內(nèi)部，細(xì)胞較大，向各個(gè)方向分裂(圖4 E)。后期頂端細(xì)胞不斷分化向外隆起形成葉原基，其包裹的頂端分生組織缺乏貯藏物質(zhì)，基部薄壁細(xì)胞中貯藏有糊粉粒及少量淀粉(圖4 F)。隨著原球莖發(fā)育，莖端分生組織向內(nèi)逐漸分化出一束維管束，維管束周圍的原形成層為一團(tuán)排列緊密、核大體積小的分生組織細(xì)胞，其代謝活動(dòng)旺盛，分裂能力強(qiáng)，會(huì)不斷分化出維管束細(xì)胞和薄壁細(xì)胞，向基部延伸連接胚根和子葉，周圍細(xì)胞形成的白色毛狀“假根”，無內(nèi)含物，是吸收營養(yǎng)的結(jié)構(gòu)(圖4 G)。基本分生組織內(nèi)細(xì)胞排列具有極性，越靠近莖端分生區(qū)細(xì)胞體積越小，排列越緊密，大多數(shù)細(xì)胞核大、液泡小，隨著分生組織細(xì)胞分裂可促進(jìn)原球莖生長伸長。葉原基逐漸形成幼葉，隨著居間分生組織的細(xì)胞分裂、增大后，葉片不斷伸長變寬(圖4 H)。維管束細(xì)胞分裂增多并在基部開始橫向延伸，形成胚根，屬于內(nèi)起源(圖4 I)。最后基本分生組織分化為液泡較大的薄壁組織，開始積累營養(yǎng)物質(zhì)，帶有假鱗莖和根的幼苗初始形成。

2.4 NaClO預(yù)處理對(duì)種皮透水透氣性的影響

對(duì)種子非共生萌發(fā)中形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，種皮木質(zhì)化是導(dǎo)致其透水透氣性差的原因之一，故必須解除這一影響才能促進(jìn)種子萌發(fā)。用NaClO溶液預(yù)處理顯著提高了萌發(fā)率(p<0.05)，2.5%的NaClO溶液處理10 min達(dá)到最佳萌發(fā)率，隨時(shí)間延長萌發(fā)率顯著下降(表2)。TTC種胚染色率與種子萌發(fā)率不存在相關(guān)性，說明種子經(jīng)NaClO溶液處理后TTC溶液更易滲進(jìn)種胚，間接證明NaClO預(yù)處理可能會(huì)破壞種皮，增加種子對(duì)氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的滲透性。但NaClO質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高或處理時(shí)間過長時(shí)，對(duì)種胚傷害較大，使部分種子失活。

表2 NaClO預(yù)處理對(duì)杜鵑蘭種子萌發(fā)的影響

3 討 論

蘭科植物種子的胚齡直接影響其萌發(fā)率，在采收的杜鵑蘭種子中，120 d未成熟種子是體外培養(yǎng)的最佳時(shí)期，證實(shí)未成熟的杜鵑蘭種子存在一個(gè)最佳的采收時(shí)期。因?yàn)榉N皮尚未發(fā)育完全，此時(shí)采收可以提高種子的發(fā)芽率，過早采收種子，培養(yǎng)條件更復(fù)雜且培養(yǎng)過程中容易死亡，晚于最佳時(shí)期采收的未成熟種子中存在抑制因素，胚胎被內(nèi)種皮包裹得更緊密，導(dǎo)致種皮產(chǎn)生休眠，影響種子萌發(fā)。在其他陸生蘭中，授粉后100 d左右的春蘭種子萌發(fā)時(shí)間最短，且有較高萌發(fā)率[20]；帶葉兜蘭的最佳采收時(shí)間為授粉后180 d，采收時(shí)間過早或過晚其萌發(fā)效果均不理想[21]。本研究初步探索了杜鵑蘭種子非共生萌發(fā)的最佳采收時(shí)期，為更好地完善杜鵑蘭非共生萌發(fā)和離體繁殖體系，還需對(duì)離體條件進(jìn)行更深入的研究。

根據(jù)外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察，確定了6個(gè)幼苗發(fā)育階段：1)無萌發(fā)，種皮完整；2)種皮破裂，露出球形胚；3)原球莖的形成；4)可見頂端分生組織和假根；5)分化出第一片葉；6)葉伸長及分化出不定根，初步形成幼苗。發(fā)育過程大致遵循蘭科植物種子發(fā)育的基本規(guī)律。杜鵑蘭胚胎被包裹在具木質(zhì)化加厚的單層細(xì)胞種皮內(nèi)時(shí)，組織分化非常有限，由頂端的小細(xì)胞和底端的大細(xì)胞組成，顯示出結(jié)構(gòu)極性，并表現(xiàn)出一種特殊的形態(tài)休眠[22]。胚吸脹至種皮破裂后，萌發(fā)后的胚成熟和幼苗發(fā)育發(fā)生在種皮之外[23]，其游離的胚胎被稱為“原球莖”。原球莖是分化發(fā)芽的胚胎還是發(fā)育不良的發(fā)芽幼苗是爭論的來源。因原球莖的兩極性，一些蘭科植物學(xué)家認(rèn)為它是發(fā)育不完全的幼苗，用于產(chǎn)生芽和根源分生組織[24]。Nishimura[25]認(rèn)為，原球莖為幼苗是因觀察到部分原球莖具有光合作用，作用類似于第一片葉子。雖然目前文獻(xiàn)中蘭科中“胚”“原球莖”和“幼苗”之間的區(qū)別還有待研究，但經(jīng)過切片觀察發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭原球莖仍在胚發(fā)育階段。有研究認(rèn)為，頂端分生組織在原球莖發(fā)育中起重要作用，遵循原套-原體學(xué)說，分生組織細(xì)胞強(qiáng)烈分裂，形成葉原基，向內(nèi)發(fā)育形成維管束，并向基部延伸然后發(fā)育成葉；Nguyen H等[26]研究表明，由具真葉的莖分生組織和根分生組織組成幼苗。因此，本研究以第一根的出現(xiàn)判定杜鵑蘭進(jìn)入幼苗期。在原球莖的基部，觀察到單細(xì)胞假根，它們吸收營養(yǎng)，或者在自然萌發(fā)的情況下可能與菌根真菌的滲透有關(guān)。蘭科植物種子從異養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)取決于葉綠素的合成，杜鵑蘭原球莖在發(fā)育期給予適當(dāng)光照，原球莖短時(shí)間轉(zhuǎn)綠。長期的黑暗容易導(dǎo)致其白化或停止發(fā)育。轉(zhuǎn)綠的原球莖通過光合作用將無機(jī)物轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)物，有利于光合產(chǎn)物的運(yùn)輸與分配，有利于干物質(zhì)積累，通常葉綠素含量越高，干物質(zhì)積累得越多。細(xì)胞組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，根狀莖的形成建立于內(nèi)部維管束組織的分化。本研究在培養(yǎng)基營養(yǎng)充足及相關(guān)激素誘導(dǎo)下，種子萌發(fā)成原球莖后可直接分化出苗。在原球莖形成及發(fā)育階段，在薄壁細(xì)胞中都觀察到淀粉顆粒，胚胎細(xì)胞中的淀粉積累可能與培養(yǎng)基中糖的存在有關(guān)[27]。存在于薄壁細(xì)胞內(nèi)的草酸鈣晶體能夠有效地對(duì)鈣進(jìn)行調(diào)節(jié)，在植物組織支持、保護(hù)及促進(jìn)植物運(yùn)輸管道的生長方面具有重要作用。本研究對(duì)杜鵑蘭幼苗早期發(fā)育階段從外部形態(tài)到內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察，可以為杜鵑蘭種子非共生萌發(fā)提供重要信息。

在自然環(huán)境中，種皮可以延長杜鵑蘭種子的存活時(shí)間，增加其與適當(dāng)共生體建立菌根聯(lián)合體的機(jī)會(huì)。然而，通過TBO預(yù)染色，種皮被染成藍(lán)綠色，表明種皮細(xì)胞壁中含有大量酚類物質(zhì)。金蘭成熟種子內(nèi)表皮中木質(zhì)素等物質(zhì)的積累，可能是抑制萌發(fā)的原因之一[28]。為了使種皮更具滲透性，使用超聲波或消毒劑進(jìn)行種子預(yù)處理對(duì)提高成熟種子的萌發(fā)率至關(guān)重要。在本研究中，杜鵑蘭的種子萌發(fā)率受NaClO處理的顯著影響，但TTC染色與種子萌發(fā)率之間不存在相關(guān)性。不同的次氯酸鹽溶液，如Ca(ClO)2和NaClO已被用于蘭科種子的表面殺菌，并有促進(jìn)種子萌發(fā)的效果[29]。而NaClO還是一種強(qiáng)氧化劑，常用于木質(zhì)素的降解[30]，可破壞種皮細(xì)胞壁增加親水性。此外，次氯酸鹽溶液還可能加速抑制物質(zhì)的浸出，例如內(nèi)源性ABA[31]。TTC染色進(jìn)行生活力測定已成功應(yīng)用于蘭科種子質(zhì)量評(píng)估，是一種可以判斷貯藏后種子活力的實(shí)用方法，但部分TTC染色法判定的種子活力與實(shí)際萌發(fā)率不符，可能是因?yàn)榉N皮限制。在C.acaule中，通過NaClO處理后，從受傷胚胎釋放脫氫酶可導(dǎo)致胚胎的生活力提高[32]。說明具有木質(zhì)化種皮的種子在其傳播過程中既可以提供保護(hù)，也能引起種子休眠。通過NaClO預(yù)處理會(huì)侵蝕種皮，破壞細(xì)胞壁的完整性，從而增加種子對(duì)氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的滲透性，而脫落酸等抑制劑可能會(huì)在種子中減少。