羅渺琴

（廣東東泰乳業(yè)有限公司公司，廣東揭陽 515500）

高效液相色譜法、氣相色譜－質(zhì)譜法、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法均屬于乳粉中維生素K1含量測定的常用方法，在大批量檢測方面，本文研究的高效液相色譜法表現(xiàn)突出，其他兩種方法測定成本較高，不適合開展大批量檢測。但如果乳粉的基質(zhì)較為復(fù)雜，高效液相色譜法可能無法滿足檢測需求，為保證高效液相色譜法更好服務(wù)于相關(guān)檢測，本文圍繞乳粉中維生素K1含量不確定度評定開展具體研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鉀、脂肪酶、氯化鋅、冰乙酸、正己烷、碳酸鉀、無水乙酸鈉、甲醇、四氫呋喃、無水乙醇和維生素K1標準品，其中甲醇、四氫呋喃均為色譜純，無水乙酸鈉、磷酸二氫鉀分別為優(yōu)級純、分析純，維生素K1標準品擁有99%以上純度[1]。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀、反相色譜柱，型號分別為U-3000、AQC18，反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

按照0.000 1 g精度稱取乳粉樣品2.0 g置入具塞三角瓶（150 mL），加入純水7 mL，溫度控制在50 ℃，搖勻使乳粉樣品充分溶解，之后將磷酸鹽緩沖液加入其中并混勻，加入量為5 mL。加入脂肪酶0.2 g，充分混合后在恒溫水浴振蕩器中進行2 h振蕩處理，溫度設(shè)置為（37±2）℃，確保充分酶解。

試樣酶解好后分別加入碳酸鉀1 g及無水乙醇10 mL，混合均勻后將水、正己烷各10 mL加入其中，振蕩或渦旋提取10 min，離心5 min，速度設(shè)置為6 000 r/min，轉(zhuǎn)移上清液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶（100 mL）中，之后加入正己烷10 mL，重復(fù)操作，進一步向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中轉(zhuǎn)移上清液。旋蒸至近干，氮氣吹干后加入甲醇5 mL并搖勻，通過0.22 μm濾膜進行過濾，濾液待進樣

1.3.2 色譜條件

參考《食品安全國家標準 食品中維生素K1的測定》（GB 5009.158—2016）內(nèi)容，設(shè)定流速為1 mL/min，激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為243 nm、430 nm，進樣量為10 μL。實驗用數(shù)學模型為：

式中：V1-提取液總體積，mL；V3-定容液總體積，mL；V2-分取的提取液體積，mL；X-維生素K1含量，μg/100 g；ρ-試樣溶液中維生素K1濃度，ng/mL；m-試樣質(zhì)量，g。

不確定度的來源可細分為6個方面，包括樣品質(zhì)量引入、標準品校正引入、樣品體積引入、儀器引入、標準曲線引入、樣品測量重復(fù)性引入的標準不確定度[2]。

2 維生素K1含量不確定度評定

2.1 樣品質(zhì)量引入

實驗過程需要稱取樣品2.000 0 g，由于存在0.5 mg的擴展不確定度及具體值為2的包含因子，可確定其存在1.25×10-3相對標準不確定度，計算過程為：

2.2 標準品校正引入

2.2.1 標準工作液引入的合成相對不確定度

（1）不確定度會因標準溶液校正引入。容量瓶（100 mL）定容標準工作液存在±0.10的最大允許誤差，屬于三角分布，因此可確定容量瓶存在4.08×10-4的相對標準不確定度，計算過程為：

（2）移液管（1 mL分度）在配置標準工作液過程中應(yīng)用，其存在0.008的最大允許誤差，屬于三角分布，因此可確定存在3.27×10-3相對標準不確定度，計算過程為：

對于20 ℃條件下校正的玻璃器具，結(jié)合（20±5） ℃的實驗室溫度，可通過估算體積膨脹系數(shù)和溫度范圍確定溫度波動帶來的不確定度，同時可忽略遠小于液體膨脹系數(shù)的玻璃膨脹系數(shù)。

（3）通過甲醇稀釋進行標準工作液配制，移取使用移液管（1 mL分度）并在容量瓶（100 mL）中定容，基于20 ℃條件下0.001 2（1/℃）的甲醇膨脹系數(shù)，標準不確定度計算需假設(shè)存在矩形分布的溫度變化，因此可得到3.46×10-3標準不確定度，計算過程為：

基于標準工作液進行分析，用urel（Ca）、urel（Cb）、urel（Cc）分別代表容量瓶、移液管、甲醇引入的相對標準不確定度。最終可得到5.90×10-3的合成相對標準不確定度，計算過程為：

2.2.2 標準品校正時的標準不確定度

還需要圍繞儀器在標準品校正時的標準不確定度進行分析，結(jié)合儀器存在的0.5%擴展不確定度及具體值為2的包含因子[3]，可確定相對標準不確定度為2.5×10-3，計算過程為：

因此存在6.41×10-3的標準品引入合成相對標準不確定度，用urel（C0）、urel（C1）分別代表標準工作液、分光光度計校正引入的合成相對標準不確定度。計算過程為：

2.3 樣品體積引入

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干的樣品需要對剩余樣品進行甲醇溶解處理，這一過程使用移液管（5 mL分度），其存在±0.025的最大允許誤差，屬于三角分布，可由此確定其存在2.04×10-3的相對標準不確定度，計算過程為：

采用相同方法，基于20 ℃條件下0.001 2（1/℃）的甲醇膨脹系數(shù)且假設(shè)存在矩形分布的溫度變化，溫度波動存在3.47×10-3相對標準不確定度。圍繞樣品體積進行分析可以確定，其存在4.03×10-3引入的合成相對標準不確定度[4]。

2.4 儀器引入

結(jié)合檢定證書信息可以確定，實驗使用的高效液相色譜儀儀器存在0.1%的相對擴展不確定度及具體值為2的包含因子，因此可確定存在5×10-4相對標準不確定度，計算過程為：

2.5 標準曲線引入

開展0.380 μg/mL、0.190 μg/mL、0.095 μg/mL、0.038 μg/mL、0.019 μg/mL和0.01 μg/mL質(zhì)量濃度的維生素K1標準工作曲線配制，分別開展1次測量，標準溶液質(zhì)量濃度－峰面積曲線通過最小二乘法擬合，標準曲線為[5]：

式中：a、b、c、分別為標準溶液的濃度（校準用）、斜率、截距、峰面積，?與校準用標準溶液濃度對應(yīng)。

結(jié)合計算獲得的數(shù)據(jù)分析截距、斜率、相關(guān)系數(shù)關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)，截距、斜率、相關(guān)系數(shù)的值分別為24.595 93、21 077.995 2、0.999 92，因此可得到校準曲線A，即：

開展奶粉試樣平行測定2次，可確定樣1、樣2的峰面積分別為5 540.22、5 563.56，濃度分別為0.261 μg/mL、0.264 μg/mL，含量分別為65.413 88 μg/100 g、65.692 82 μg/100 g，結(jié)合平均試樣濃度和平均峰面積，可確定2次重復(fù)測定能夠帶來0.663%的相對標準不確定度，計算過程為：

2.6 樣品測量重復(fù)性引入

開展維生素K1平行測試，目標為同一批次乳粉試樣，總的分析數(shù)據(jù)隨機變化能夠由此獲取，如測定次數(shù)為1、3、7、10 時的測定結(jié)果分別為 65.4 μg/100 g、66 μg/100 g、63.6 μg/100 g、60.6 μg/100 g，10 次平均值為 64.2 μg/100 g。圍繞重復(fù)測量樣品開展評定，平均值標準偏差用于平均值的標準不確定度表征，可得到8.03×10-3的相對標準不確定度，計算過程需結(jié)合所測結(jié)果r的平均值標準偏差及標準不確定度，分別表示為可得到計算公式：

2.7 相對標準不確定度合成

結(jié)合測量樣品質(zhì)量、標準品校正、樣品體積、儀器、標準曲線和樣品測量重復(fù)性共6種來源的相對標準不確定度，可確定乳粉中K1測定過程中高效液相色譜法的不確定度，即0.977 25 μg/100 g，用urel（C）、urel（V）、urel（m）、urel（q）、urel（s）、urel（r）分別代表標準品、樣品定容體積、樣品質(zhì)量、標準曲線、儀器、測量重復(fù)性的相對標準不確定度。計算過程為：

2.8 擴展不確定度

結(jié)合數(shù)值為2的包含因子及95%的置信水平，可通過計算得到擴展不確定度，具體數(shù)值為1.954 5 μg/100 g，計算過程為：

3 結(jié)論

通過對實驗過程進行分析可以發(fā)現(xiàn)，乳粉維生素K1測定中，高效液相色譜法的實用性較高，能夠確定樣品質(zhì)量、標準品校正、樣品體積、儀器、標準曲線和樣品測量重復(fù)性等方面引入的不確定度，高效液相色譜法應(yīng)用中受到的最小二乘法擬合曲線影響最大，因此可以確定其涉及的濃度值屬于不確定度測量的主要影響因素，在高效液相色譜法的應(yīng)用中必須對其進行針對性控制，以此得到可靠性更高的檢測結(jié)果，同時保證測量結(jié)果間存在更高的可比性，為測定乳粉維生素K1含量提供更好的支持。