石雪芬，石美蓮

（深圳信測(cè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，廣東深圳 518000）

隨著全球范圍的百草枯禁限用不斷加大，草銨膦繼草甘膦之后，成長(zhǎng)為第二大除草劑，近年來(lái)市場(chǎng)比重加大。草甘膦和草銨膦屬于滅生性除草劑，有廣譜、低毒、高效等綜合性質(zhì)，被廣泛施用于果園，其殘留問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注。目前關(guān)于草甘膦和草銨膦毒性問(wèn)題存在爭(zhēng)議，但由于兩者農(nóng)藥使用范圍廣，用量大，不排除通過(guò)食物鏈對(duì)動(dòng)物及人體產(chǎn)生潛在毒性?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）規(guī)定了茶葉中草銨膦和草甘膦的限量[1]。

草甘膦及產(chǎn)物氨甲基膦酸和草銨膦常用的檢測(cè)方法有分光光度法、電感耦合等離子光譜法（ICP）、色譜法（IC、LC、GC）、質(zhì)譜法（LC-MS/MS、GC-MS），然而氣質(zhì)法需衍生氣化后才能用，過(guò)程繁瑣。液相色譜紫外法基質(zhì)較復(fù)雜，定性難度大，而LC-MS/MS具有較高的選擇性和靈敏度[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

茶葉，購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；氯甲酸-9-芴基甲酯，純度99.0%；乙腈、甲酸、乙酸銨，均為色譜純?cè)噭粯?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（草甘膦 100 μg/mL，k=2，3%；氨甲基膦酸 100 μg/mL，k=2，3%；草銨膦100 μg/mL，k=2，3%。A Chemtek Inc.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)草甘膦-13C215N 99.9 μg/mL，k=2，3%），購(gòu)自壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

1.1.2 儀器

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，SCIEX TRIPLE QUAD?4500；萬(wàn)分之一電子天平，上海精其FA2204N；多管渦旋混旋儀，上海精其LF-200；臺(tái)式離心機(jī)，凱特TD5；數(shù)顯恒溫水浴鍋，DK-S24；水浴恒溫振蕩器，HA2A。

1.2 溶液的配制

①硼酸鈉溶液（50.0 g/L，pH=9）。稱取5 g硼酸鈉，用水溶解并定容至100 mL。②氯甲酸-9-芴基甲酯乙腈溶液（FMOC-Cl）。稱取1 g氯甲酸-9-芴基甲酯，用乙腈溶解并定容至100 mL。③乙酸銨溶液（0.1%甲酸溶液）。稱取0.154 g乙酸銨溶于適量水中，用水定容1 000 mL后加入甲酸1 mL。

1.3 樣品的提取、凈化和衍生。

①精密稱取茶葉（1±0.01）g，置于離心管中，加入1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)0.20 mL和10 mL 0.05 mol/L NaOH溶液，渦旋混勻40 ℃水浴振蕩提取20 min，離心后取2 mL上清液于裝有50 mg PSA的10 mL離心管中凈化，再取凈化試液1.0 mL至離心管中，加入0.2 mL的硼酸鈉溶液，搖勻后再加入0.2 mL FMOC-Cl衍生試劑，渦旋混勻振搖后置于40 ℃衍生4 h，離心后過(guò)水系濾膜，供液質(zhì)分析，同時(shí)做空白試驗(yàn)。②分別配制濃度為1～80 ng/mL，且內(nèi)標(biāo)濃度為10 ng/mL的混標(biāo)，各取1 mL，衍生與樣品同法操作[3]。

1.4 儀器設(shè)備及參數(shù)信息

1.4.1 色譜條件

儀器型號(hào)：SCIEX TRIPLE QUAD? 4500；色譜柱信息：Agilen（tUSDAY64791）；類型：ZORBAX SB-C18；規(guī)格：2.1 mm×50 mm，1.8 μm；流動(dòng)相：A為乙腈，B為2 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸溶液）；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；梯度：0.3～3.0 min，90%的A保持1 min；2～3 min A相降低至10%；3.1 min A相升高至90%并保持2 min至5 min結(jié)束。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI+源；模式：正模式；掃描模式為MRM；離子源溫度500 ℃，離子源氣壓50 psi；離子噴霧電壓5 500 V；氣簾氣25 psi；碰撞氣8 psi，衍生物參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 衍生物參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦含量的計(jì)算

草甘膦的含量是以草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸之和計(jì)，若以草甘膦表示則需換算，查資料可知草甘膦的分子量為169.07，氨甲基磷酸的分子量為111.04，氨甲基磷酸換算為草甘膦的系數(shù)為0.656 8；即以草甘膦表示的結(jié)果計(jì)算公式為：草甘膦的含量+氨甲基磷酸的含量 ×0.656 8。

2.2 方法的線性、檢出限及定量限

標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和80 ng/mL，驗(yàn)證正確度和精密度時(shí)，3水平濃度平行取樣測(cè)定6次。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法的線性、檢出限及定量限

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

試驗(yàn)表明，流動(dòng)相優(yōu)化包括乙腈-水、乙腈-2mmol/L甲酸銨、乙腈-2mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）、乙腈-5mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）。結(jié)果表明，采用乙腈-2mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）作為流動(dòng)相，緩沖體系更穩(wěn)定，能提高目標(biāo)化合物離子化效率，化合物分離度和靈敏度都達(dá)到最佳[4]。

2.4 提取劑的優(yōu)化及凈化材料的選取

草甘膦及代謝物氨甲基磷酸和草銨膦均是強(qiáng)極性化合物，難溶于丙酮、二氯甲烷等有機(jī)溶劑。試驗(yàn)選取乙腈（0.1%甲酸）、pH=6.0的水溶液、0.05 mol/L NaOH溶液等作為提取溶劑茶葉中的3種目標(biāo)分析物進(jìn)行提取。同時(shí)對(duì)比了不同的凈化材料，如C18、CAX固相萃取柱、50 mg PSA、100 mg PSA、二氯甲烷試劑，綜合考慮成本、提取效率等因素，最終采用0.05 mol/L NaOH溶液等作為提取溶劑，50 mg PSA作為凈化材料提取目標(biāo)分析物效果最好[5]。

2.5 衍生劑時(shí)間的優(yōu)化

草甘膦及代謝物氨甲基磷酸和草銨膦分子量較小，直接檢測(cè)信號(hào)不強(qiáng)。而在堿性環(huán)境（pH=9）下，通過(guò)FOMC-基團(tuán)取代目標(biāo)化合物氮原子上的氫，生成較穩(wěn)定的化合物FOMC-R。在茶葉基質(zhì)中添加過(guò)量衍生試劑條件下，對(duì)衍生反應(yīng)時(shí)間（1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和24 h）進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明在40 ℃，pH=9時(shí)衍生反應(yīng)4 h后，測(cè)得衍生化合物含量無(wú)明顯增加，確認(rèn)了最佳的衍生時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同時(shí)間衍生結(jié)果的趨勢(shì)圖

3 結(jié)論

本方法研究同時(shí)檢測(cè)茶葉中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸和草銨膦殘留，優(yōu)化了色譜條件的前處理?xiàng)l件，從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)了茶葉，采用0.05 mol/L NaOH溶液等作為提取溶劑，50 mg PSA作為凈化材料提取，加標(biāo)濃度為0.01～0.60 mg/kg，精密度為1.03%～2.36%，回收率為81.8%～107.2%，得到較為滿意的測(cè)試方法，過(guò)程高效，簡(jiǎn)單快速，可用于大批量樣品的快速檢測(cè)。