胡圓圓，楊云忠，王 萍，李紹仙，李 艷，車 濤

（普洱市質量技術監(jiān)督綜合檢測中心，云南普洱 665000）

普洱茶是以地理標志保護范圍內的云南大葉種曬青茶為原料，并在地理標志保護范圍內采用特定的加工工藝制成，具有獨特品質特征的茶葉[1]。它品性溫和，獨具陳香、醇厚、甘滑的韻味。由于普洱茶具有“越陳越香”的特點，有人稱為“可以喝的古董”[2]。普洱茶湯中獨特的口味和色澤越來越受現(xiàn)代人的青睞，它當中的主要成分是“茶褐素”。

茶褐素是指茶葉中以兒茶素為主的多酚類化合物氧化聚合而成的大分子水溶性色素，是一類易溶于水，但不溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇及三氯甲烷等有機溶劑的高聚合物質[3]。其化學組成主要由含多苯環(huán)的褐色色素、多糖殘基、蛋白殘基、咖啡堿以及脂類物質組成，主要的功能性基團為羧基、羥基、氨基以及甲基等基團，具有酚類物質特性。其主要形成途徑認為是有多酚氧化形成的茶紅素、茶黃素與蛋白質、多糖、咖啡堿及脂類物質在微生物分泌酶的酶促作用、微生物“呼吸熱”以及濕熱作用下通過氧化聚合、偶聯(lián)聚合等方式形成，一部分可溶入茶湯，一部分則殘留于葉底。茶褐素具有減肥、調節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化和抗氧化等作用，是普洱茶的主要活性物質[4-6]。

因此能準確測定普洱茶中茶褐素的含量對推動普洱茶產業(yè)發(fā)展起推動作用，但傳統(tǒng)的檢測方法對測定結果的不穩(wěn)定性。本文參考楊妍等[7]方法進行了一系列相關的驗證試驗，均得到準確的測定結果。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

普洱茶葉與茶粉由云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司提供；無水乙醇（天津市化學試劑三廠）；蒸餾水：符合《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計（TU-1810SPC，北京普析通用儀器有限責任公司）；旋轉蒸發(fā)儀（R-215，瑞士）；高速冷凍離心機（GL-12B，上海安亭科學儀器廠）；萬分之一分析天平(ME614S，Sartorius)；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；抽濾泵（臺州市黃巖匯豐真空設備）。

1.3 實驗方法

1.3.1 茶褐素標準品的制備

精確選取優(yōu)質茶樣30個，在電子天平上稱重，每個茶樣稱取100 g。將稱好的茶樣進行充分混勻，按料液比為1∶10的比例加入沸水，保溫浸提兩次，每次30 min，得茶湯，用濾布過慮茶湯，得到澄清的湯液，對過濾后的茶湯進行真空減壓濃縮，然后對濃縮液進行離心。向離心后的茶湯濃縮液中加入無水乙醇至乙醇含量為總量的80%，靜置6 h，離心得沉淀。得到該沉淀即為茶褐素標準品，在60 ℃條件下烘干，為制作標準曲線做準備。取50 g以上得到的茶褐素沉淀（即標準品），加入1 000 mL蒸餾水充分攪拌，使其全部溶解。對溶解進行分級，使用＞50 000 Da的濾膜，分級后依次得到物質，并進行冷凍干燥得到干物質。然后以＞50 000 Da的茶褐素作為標準品。

1.3.2 供試品溶液的制備

（1）普洱茶葉溶液的制備。準確稱取3.00 g茶樣，加入沸水（蒸餾水）150 mL，搖勻后在沸水浴中浸提10 min，收集茶湯（浸提中搖瓶1次），取出搖勻，趁熱用濾紙過濾于三角瓶中，冷卻至室溫。將濾液倒入燒杯，加入無水乙醇至乙醇含量為80%，靜置5 h后進行離心（4 500 r/min，10 min）后得沉淀。向沉淀中加入100 mL蒸餾水，溶解，吸取溶液1 L放入100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL。此溶液作為供試品溶液。

（2）普洱茶粉溶液的制備。直接稱取茶粉樣品（約0.500 0 g）溶解于100 mL蒸餾水中，吸取1 mL濾液放入100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL。此溶液作為供試品溶液（＞50 000 Da）。

1.3.3 茶褐素標準曲線的繪制

準確稱取0.025 0 g（＞50 000 Da）的標準品，加蒸餾水溶解，定容至250 mL（c=0.1 mg/mL）。分別取0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL、8.0 mL、9.0 mL和10.0 mL標準品于11支試管，分別加蒸餾水補至10 mL，靜置。分別在270 nm波長下比色（0 mL試管作空白），以濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線，求得回歸方程：y=9.489 3x-0.003 8。

1.3.4 普洱茶及茶粉樣品的測定

將供試品溶液，用紫外分光光度計在270 nm波長下，用1 cm厚的石英比色皿，蒸餾水為空白，測定溶液的吸光度。每個樣品重復測定3次，每次做3個平行。普洱茶及茶粉中茶褐素含量的測定按下列公式計算：

式中：A為270 nm下測定的吸光值；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

精密稱取0.025 0 g＞50 000 Da茶褐素標準品，加蒸餾水溶解，定容至250 mL。標準品濃度為（c=0.1 mg/mL）。分別取0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL、8.0 mL、9.0 mL及10.0 mL標準品于11支試管，分別加蒸餾水補至10 mL，靜置。分別在270 nm波長下比色（0 mL試管作空白），以濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線，求得回歸方程：A=10.024 1C+0.000 1，見圖1。

圖1 茶褐素的標準曲線

2.2 精密度實驗

取同一批號的樣品約0.5 g，按照供試品溶液的制備方法操作，按供試品溶液的測定方法，于270 nm處連續(xù)測定吸光度6次。普洱茶RSD值為0.50%，茶粉RSD值為0.42%，結果見表1。

表1 精密度試驗結果

2.3 重復性實驗

取同一批號的樣品，共計6份，按照供試品溶液制備方法操作，按供試品溶液的測定方法，于270 nm處連續(xù)測定吸光度。茶粉標準偏差RSD為0.51%，普洱茶（熟茶）RSD為0.54%結果穩(wěn)定，見表2和表3。

表2 茶粉的重復性試驗結果

表3 普洱茶（熟茶）的重復性試驗結果

2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一批號的樣品，稱樣量5.005 g，按照供試品溶液制備方法操作，按供試品溶液的測定方法，在0 h、2 h、4 h、 6h、8 h、10 h及12 h于270 nm處測定起吸光度。當時間放置在6 h以上時，吸光值趨于穩(wěn)定，見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗結果

2.5 回收率實驗

取同一批號樣品，共計6份，按照供試品溶液制備方法操作，加入茶褐素標品，進行加標回收實驗，按供試品溶液的測定方法，于270 nm處連續(xù)測定吸光度，計算茶褐素含量，結果見下表5和表6。通過表5和表6，茶粉的回收率在96.0%～98.0%，普洱茶（熟茶）回收率在96.0%～98.0%?；厥章蕦嶒炐Ч茫欣趯悠返臏y定。

表5 茶粉回收率試驗結果

表6 普洱茶（熟茶）回收率試驗結果

3 討論

通過對該方法一系列的驗證，可以得出該檢測方法具有較好的線性范圍、較高的精密度、良好的穩(wěn)定性和重復性及較高的回收率。本方法通過根據(jù)標準品來測定茶褐素，方法簡單、易行，操作簡便，測定結果穩(wěn)定更接近真實值，準確可信，適用于茶葉及茶制品中茶褐素的測定。