王玉梅，劉 真，李 丹，楊軍麗

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇南京 211198）

赭曲霉毒素A（Ochratoxin，OTA）是由多種青霉屬和曲霉屬真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，目前在多種糧食及制品中都檢測(cè)出OTA的情況[1]。人和動(dòng)物進(jìn)食被OTA污染的食物后，由于OTA在體內(nèi)代謝較慢，會(huì)在體內(nèi)蓄積，目前糧食及其制品中的OTA的檢測(cè)情況已引起國內(nèi)外的高度關(guān)注[2]。我國目前還沒有關(guān)于人群OTA膳食攝入量的評(píng)價(jià)研究，但食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了谷物等糧食及制品中OTA的限量為5 μg/kg，同時(shí)指明了其方法標(biāo)準(zhǔn)為GB 5009.96—2016[3]。本文參照《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》（JJF 1135—2005）[4]和《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[5]，依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定》（GB 5009.96—2016）[3]分析小麥粉中赭曲霉毒素A的不確定度，為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供科學(xué)準(zhǔn)確的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品（PriboFast，CAS號(hào)303-47-9，純度為99.0%）；色譜級(jí)乙腈、甲醇、冰乙酸；分析純氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、濃鹽酸；陽性小麥粉樣品（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 儀器與設(shè)備

島津液相色譜儀（LC-20AD）；電子天平；離心機(jī)；渦旋振蕩器；赭曲霉毒素A免疫親和柱（PriboFast，≥100 mg，3 mL），定量濾紙，玻璃纖維濾紙。

1.3 前處理方法

按GB 5009.96—2016[3]標(biāo)準(zhǔn)方法。糧食和糧食制品。樣品需全部粉碎且通過孔徑1 mm的篩后混勻后備用。稱取試樣25.0 g，加入100 mL乙腈水溶液（體積比6+4），高速均質(zhì)3 min，準(zhǔn)確量取濾液4 mL后加入26 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），并充分混合均勻，置于高速離心機(jī)中離心（10 000 r/min，5 min），取上清待過柱備用。將全部濾液過赭曲霉毒素A免疫親和柱（PriboFast，≥100 mg，3 mL），依次使用10 mL PBS緩沖液、10 mL水淋洗赭曲霉毒素A免疫親和柱，棄去流出液并抽干小柱，最后使用1.5 mL的甲醇洗脫，用干凈離心管收集洗脫液，置于氮?dú)鈨x吹干（45 ℃）。用流動(dòng)相溶解殘?jiān)⒍ㄈ莸?00 μL，供上機(jī)檢測(cè)。

1.4 樣品中赭曲霉毒素A殘留量計(jì)算

樣品中赭曲霉毒素A殘留量計(jì)算如式（1）所示。

式中：X—樣品中赭曲霉毒素A殘留量，μg/kg；C—儀器檢出目標(biāo)物濃度，ng/mL；V—試樣最終定容體積，mL；m—樣品稱樣量，g；K—稀釋倍數(shù)，K=25。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器測(cè)定赭曲霉毒素A含量C產(chǎn)生的不確定度

赭曲霉毒素A含量的不確定度主要包括以下兩個(gè)方面，即配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液產(chǎn)生的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)曲線配制產(chǎn)生的不確定度。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制產(chǎn)生的不確定度Uc(1)

于10 mL容量瓶中放入準(zhǔn)確稱取的10 mg的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%），用甲醇溶解后并定容至容量瓶刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其濃度為1 000 μg/mL。

（1）赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品純度產(chǎn)生的不確定度。從其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書中獲取相關(guān)信息，赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品的純度＞99%，按均勻分布來計(jì)算，由其純度產(chǎn)生的相對(duì)不確定度分別為

（2）稱量赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的不確定度?！稊?shù)字指示秤》（JJG 539—2016）標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了：在0～5 g稱量范圍內(nèi)，電子天平的最大允許誤差為±0.05 mg，因此可以得到天平稱量標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為

（3）配制赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液時(shí)由定容體積產(chǎn)生的不確定度?！冻Ｓ貌ＡЯ科鳈z定規(guī)程》（JJG 196—2006）[6]標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，溫度為20 ℃時(shí)100 mL的A級(jí)容量瓶允差誤差為±0.1 mL，按對(duì)稱分布計(jì)算不確定度為溫度為20 ℃，定容液甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.1×10-3/℃，按均勻分布計(jì)算，100 mL的容量瓶由溫度產(chǎn)生的體積不確定度為綜合以上兩部分合成得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.2 稀釋赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液過程中產(chǎn)生的不確定度Uc(2)

火燒油層技術(shù)雖然驅(qū)油效果較好，但其有諸多技術(shù)難點(diǎn)：無法控制地下真實(shí)燃燒狀態(tài)；對(duì)燃燒帶前緣的調(diào)整與控制；點(diǎn)火、注氣、舉升工藝對(duì)裝備的要求較高；產(chǎn)出流體的檢測(cè)和安全環(huán)?？刂戚^難。

稀釋過程中使用1 mL的移液管移取赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL于100 mL A級(jí)容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，得到濃度為10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1；移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1,用甲醇定容于100 mL A級(jí)容量瓶中，得到標(biāo)準(zhǔn)中間溶液2，濃度為100 ng/mL。取均勻分布，產(chǎn)生的不確定度見表1。

表1 稀釋赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液過程中引入的不確定度

由儲(chǔ)備液稀釋過程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.3 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及擬合產(chǎn)生的不確定度Uc(3)

移取適量流動(dòng)相將赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度為 0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL和50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，進(jìn)樣體積為50 μL，每個(gè)點(diǎn)均平行測(cè)定2次，測(cè)定數(shù)據(jù)見表2。

表2 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

取陽性小麥粉樣品，對(duì)其中赭曲霉毒素A濃度C0進(jìn)行2次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果見表3。通過高效液相色譜自動(dòng)定量軟件分析得到相應(yīng)色譜峰面積A，擬合得到線性回歸方程Ai=aCi+b，其中a為斜率，b為截距。

表3 陽性小麥粉樣品測(cè)量數(shù)據(jù)

由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度為

Uc(3)=，其中SR為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差n為測(cè)試次數(shù)，本試驗(yàn)中n=7×2=14；p為對(duì)C0的測(cè)定次數(shù)，為標(biāo)準(zhǔn)溶液平均濃度，則Uc(3)=0.742 1，0.032 89。

2.2 測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度U()

在空白小麥粉試樣中添加1.0 μg/kg的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果見表4。計(jì)算得到

表4 小麥粉中赭曲霉毒素A測(cè)定結(jié)果

2.3 由試驗(yàn)回收率引入的不確定度U(R)

2.4 稱量樣品時(shí)產(chǎn)生的不確定U(m)

按本試驗(yàn)要求，稱取小麥粉25 g，電子天平最大允差是±0.005 g，取均勻分布，其產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為

2.5 量取體積時(shí)產(chǎn)生的不確定U(V)

量取體積產(chǎn)生的不確定度主要分為定容體積和進(jìn)樣體積兩部分引入的不確定度組成。

2.5.1 定容體積產(chǎn)生的不確定度U(V1)

小麥粉樣品按照試驗(yàn)方法經(jīng)提取凈化，最終使用1 mL A級(jí)移液管定容至0.50 mL，允差為±0.007 mL，取均勻分布，其相對(duì)不確定度為

2.5.2 上機(jī)體積產(chǎn)生的不確定度U(V2)

高效液相色譜進(jìn)樣針容積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為±1%，取均勻分布，其相對(duì)不確定度

結(jié)合以上兩部分引入的不確定度，由體積量取引入的合成不確定度為

3 合成不確定度

U(x)=依據(jù)JJF 1135—2005[5]，在95.45%的置信水平下，取包含因子k=2，赭曲霉毒素A的測(cè)定值為1.12 μg/kg，擴(kuò)展不確定度

4 測(cè)定結(jié)果

按照該方法測(cè)定小麥粉中赭曲霉毒素A的結(jié)果為：