陳佩瑤，姜立春，胡榆琳，趙秋月

（綿陽師范學(xué)院，四川綿陽 621000）

魚腥草（英文名：Herba Houttuyniae）是三白草科植物蕺菜屬植物蕺菜（拉丁學(xué)名：Houttuynia cordataThunb.）的干燥地上部分及新鮮全草[1]。藥理試驗(yàn)表明，魚腥草具有抗菌[2]、抗炎[3-6]、抗過敏、鎮(zhèn)痛和止血等功效。從魚腥草中提取出的黃酮能清除體內(nèi)自由基，被用來治療心血管疾病。

本試驗(yàn)旨在通過利用單因素及響應(yīng)面分析，探究料液比、接種量、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度對(duì)魚腥草發(fā)酵提取總黃酮得率的影響，為提高魚腥草發(fā)酵液中黃酮含量提供新的研究方向和思路，以期為魚腥草發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

魚腥草（購(gòu)于綿陽永興康貝大藥房）。

1.2 試劑

酵母菌（安琪酵母股份有限公司）、果膠酶（和氏璧生物科技有限公司）、蛋白酶（和氏璧生物科技有限公司）、纖維素酶（和氏璧生物科技有限公司）、蘆?。ㄉ虾Ｈ缂锟萍紝?duì)照品專用）、蛋白胨（OXOID LTD）、酵母浸粉（OXOID LTD）等。

1.3 儀器設(shè)備

DZTW型電熱套、LKTC-B1型水浴鍋、SC-3610型低速離心機(jī)、MS-3020型自控高壓消毒鍋、BCD-216E/B型低溫冰箱、SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)、DHP-600型電熱恒溫干燥培養(yǎng)箱

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 魚腥草發(fā)酵工藝

將魚腥草莖段切成1 cm小段，浸泡于蒸餾水中，漂洗3次后瀝干，40 ℃烘箱中干燥至恒重后粉碎2次，5 min/次，過40目篩。根據(jù)一定料液比配制成魚腥草懸浮液，在40 ℃水浴溫度下浸提3 h，浸提后加入50 ℃水浴鍋中用一定的酶進(jìn)行酶解3 h，將酶解后的魚腥草溶液調(diào)pH至4左右，105 ℃，滅菌30 min。冷卻后的魚腥草溶液接種一定量的活化酵母，在一定培養(yǎng)溫度下，恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間，發(fā)酵結(jié)束取濾液待測(cè)。

1.4.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

盧丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。于100 mL容量瓶中加入10 mg蘆丁對(duì)照品、10 mL甲醇，待對(duì)照品溶解后，用蒸餾水定容，搖勻，制成0.1 mg/mL的盧丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用可見分光光度計(jì)，波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.790 4x，R2=0.992 1。根據(jù)R2=0.992 1可知，黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。

1.4.3 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)考察了料液比、接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和酶解時(shí)酶種類5個(gè)因素對(duì)黃酮提取率的影響。料液比分別為1∶12、1∶16、1∶20、1∶24和1∶28，酵母菌接種量分別為0.5%、1%、2%、4%和6%，發(fā)酵時(shí)間分別為3 d、5 d、7 d、9 d和11 d，發(fā)酵溫度分別為23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃和35 ℃，酶解時(shí)酶種類分別為果膠酶、果膠酶+蛋白酶、果膠酶+纖維素酶和果膠酶+纖維素酶+蛋白酶。

1.4.4 分析方法

（1）總黃酮含量的測(cè)定。采用紫外分光光度法測(cè)定樣品中的總黃酮含量[7]。

（2）數(shù)據(jù)分析。采用Excel2019和Design-Expert8.0.6Trial軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響

根據(jù)1.4.1方法，分析料液比對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果如圖1所示。隨著料液比的增加，黃酮含量先升高后下降，在料液比為1∶24時(shí)，黃酮含量達(dá)到峰值，黃酮含量為0.091 mg/mL，此時(shí)發(fā)酵效果最好。

圖1 料液比對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響

2.1.2 接種量對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響

根據(jù)1.4.1方法，分析接種量對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著酵母菌接種量的增加，總黃酮含量先緩慢增加，再緩慢減少，最終趨于平穩(wěn)；當(dāng)酵母菌接種量為4%時(shí)，總黃酮含量最高，為0.08 mg/mL。

圖2 菌種接種量對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響

根據(jù)1.4.1方法，分析發(fā)酵時(shí)間對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，黃酮含量先緩慢增加后緩慢減少。當(dāng)培養(yǎng)天數(shù)為7 d時(shí)，總黃酮含量達(dá)到峰值，為0.091 mg/mL。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響

根據(jù)1.4.1方法，分析發(fā)酵溫度對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著發(fā)酵溫度的升高，總黃酮含量先緩慢增加后緩慢減少。當(dāng)發(fā)酵溫度為29 ℃時(shí)，總黃酮含量最高，為0.086 mg/mL。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響

2.1.5 酶解菌種對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響

根據(jù)1.4.1方法，分析酶解菌種對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果如圖5所示（A為果膠酶，B為蛋白酶，C為纖維素酶）。當(dāng)酶種為A+B+C時(shí)，總黃酮含量達(dá)到峰值，為0.082 mg/mL。

圖5 酶解種類不同對(duì)魚腥草發(fā)酵結(jié)果的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及最優(yōu)條件的確定[8-9]

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面對(duì)魚腥草發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，分別選取A料液比、B接種量、C發(fā)酵時(shí)間、D發(fā)酵溫度，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以總黃酮得率作為考察指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到以黃酮為響應(yīng)值的回歸 線 方 程 為：Y=0.089+3.250×10-3×A+3.147×10-3×B+3.500×10-3×C+3.000×10-3×D+7.500×10-4×AB+7.500×10-4×AC+1.750×10-3×AD-1.250×10-3×BC+2.500×10-3×BD+5.000×10-4×CD-8.683×10-3×A2-6.433×10-3×B2-9.808×10-3×C2-7.558×10-3×D2（R2=0.941 0，P＜ 0.000 1）。

由表2可知，回歸方程的P＜0.000 1，說明該回歸方程模擬效果極顯著，失擬項(xiàng)P=0.376 5＞0.05，說明失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，回歸方程模型擬合度高，試驗(yàn)誤差對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾性較低。R2=0.941 0，說明響應(yīng)面的理論值和實(shí)際值呈較為顯著的相關(guān)性。此外，模型A、B、C、D對(duì)黃酮得率的影響極顯著（P＜0.01）。從F值的大小可以看出，發(fā)酵條件的4個(gè)因素對(duì)魚腥草發(fā)酵的影響大小為：C發(fā)酵時(shí)間＞B接種量＞A料液比＞D發(fā)酵溫度。

表2 回歸模型方差分析

利用Design-Expert軟件繪制料液比、接種量、發(fā)酵時(shí)間以及發(fā)酵溫度4個(gè)因素之間的交互作用對(duì)總黃酮得率的響應(yīng)面，結(jié)果如圖6所示。

圖6反映了料液比、接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度4個(gè)因素之間兩兩交互作用對(duì)黃酮提取率的影響。從響應(yīng)曲面圖中可以看出，各個(gè)因素在試驗(yàn)設(shè)定的參數(shù)范圍內(nèi)都存在最高點(diǎn)，說明試驗(yàn)設(shè)定參數(shù)合理。結(jié)合表2可以得出，AB、AC、AD、BC、BD、CD兩兩交互作用對(duì)黃酮得率影響不顯著（P＞ 0.05）。

圖6 各因素對(duì)發(fā)酵樣品中黃酮得率影響的響應(yīng)曲面圖

2.3 黃酮最優(yōu)提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)

綜合響應(yīng)面結(jié)果分析出的魚腥草發(fā)酵總黃酮得率最優(yōu)條件為料液比為1∶24.47；接種量為6.31%；發(fā)酵時(shí)間為7.18 d；發(fā)酵溫度為29.56 ℃，此時(shí)魚腥草發(fā)酵黃酮含量值為0.091 mg/mL。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，且從實(shí)際情況出發(fā)，將魚腥草的發(fā)酵工藝參數(shù)調(diào)整為：料液比為1∶25；接種量為6%；發(fā)酵時(shí)間為7 d；發(fā)酵溫度為30 ℃，在此試驗(yàn)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出黃酮提取率平均值為（0.095±0.004） mg/mL，與響應(yīng)面分析得到的預(yù)測(cè)值基本符合，因此該響應(yīng)面模型優(yōu)化的黃酮提取率可靠性較高。

3 結(jié)論

本研究以魚腥草為原料，以黃酮含量作為試驗(yàn)指標(biāo)，選取料液比、接種量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度作為影響因子，利用單因素試驗(yàn)探究對(duì)魚腥草發(fā)酵產(chǎn)黃酮的影響，再利用響應(yīng)面分析影響因子之間的交互作用及最佳發(fā)酵工藝條件，研究結(jié)果表明：影響作用：發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞料液比＞發(fā)酵溫度；發(fā)酵優(yōu)化條件為料液比1∶25，接種量6%，發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵溫度30 ℃，在此條件下，魚腥草發(fā)酵提取到的黃酮得率的平均值為（0.095±0.004） mg/mL，說明響應(yīng)面模型可靠性高。