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        復(fù)方鮮竹瀝液微生物限度檢查法的建立

        2021-02-14 10:58:18張靜張春華周萍章瑛謝茵
        藥品評(píng)價(jià) 2021年23期

        張靜,張春華,周萍,章瑛,謝茵

        江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心,江西 南昌 330029

        復(fù)方鮮竹瀝液為江西省特色中藥制劑,檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》(簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)2020 年版一部[1],標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其微生物限度要求較為嚴(yán)格,需氧菌總數(shù)≤102cfu,霉菌和酵母菌總數(shù)≤10 cfu,并不得檢出大腸埃希菌。復(fù)方鮮竹瀝液處方包括鮮竹瀝、生半夏、魚(yú)腥草、枇杷葉、桔梗、生姜、薄荷素油等七味藥材,用于痰熱咳嗽,痰黃黏稠等。該制劑為合劑,含有豐富的維生素和水分,pH 在4.8~6.0 之間,處方中又加入蔗糖或甜菊素等微生物生長(zhǎng)所需的物質(zhì),環(huán)境極易于微生物的生長(zhǎng)和繁殖。制劑的微生物污染程度,對(duì)制劑的有效性、穩(wěn)定性和安全性都產(chǎn)生重大的影響,也直接關(guān)系到臨床用藥的安全[2-4]。鑒于復(fù)方鮮竹瀝液的使用較廣,生產(chǎn)企業(yè)較多,有必要對(duì)其微生物污染狀況進(jìn)行研究,建立適用于不同企業(yè)的微生物限度檢查方法,為復(fù)方鮮竹瀝液的用藥安全和質(zhì)量控制提供參考。本研究選擇了江西省內(nèi)6 家生產(chǎn)企業(yè)共計(jì)9 批次復(fù)方鮮竹瀝進(jìn)行方法學(xué)考察及驗(yàn)證。

        1 儀器與試劑

        1.1 儀器

        YXQ-LS-50S Ⅱ高壓蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)醫(yī)療器械有限公司),Sartorius T601-L 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司),SW-CJ-2D 凈化工作臺(tái)(蘇州凈化有限公司),PYX-DHS 細(xì)菌培養(yǎng)箱、MJ-160B 霉菌培養(yǎng)箱、PYX-DHS 隔水式恒溫培養(yǎng)箱(均為上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

        1.2 培養(yǎng)基與菌種

        胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(北京三藥科技開(kāi)發(fā)有限公司,批號(hào):20200324),胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司,批號(hào):191104),沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司,批號(hào):20200310),沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司,批號(hào):20200310),麥康凱液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20190927),麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20191121),4-甲基傘形酮葡糖苷酸-蛋白胨培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20191124)。上述培養(yǎng)基進(jìn)行適用性檢查,生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示特性均符合實(shí)驗(yàn)要求。

        菌種均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。使用菌種信息如下:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501],金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003],銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104],白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001],黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003],大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]。以下使用菌種均按《中國(guó)藥典》2020 年版要求稀釋制備,做活菌計(jì)數(shù)備用。

        1.3 樣品

        抽取江西省內(nèi)6 家生產(chǎn)廠家,包括江西南昌濟(jì)生制藥有限責(zé)任公司3 批(規(guī)格:10 mL、20 mL,150 mL),江西遠(yuǎn)東藥業(yè)股份有限公司1 批(規(guī)格:10 mL),江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司2 批(規(guī)格:10 mL、20 mL),江西匯仁藥業(yè)股份有限公司1 批(規(guī)格:10 mL),江西天施康中藥股份有限公司1 批(規(guī)格:10 mL),江西九華藥業(yè)有限公司1 批(規(guī)格:10 mL),共計(jì)9 批次復(fù)方鮮竹瀝液。

        2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

        建立樣品的微生物限度檢查法時(shí),首先需進(jìn)行方法的驗(yàn)證,以證明所采用的方法適合于該樣品的微生物限度檢查,也就是確認(rèn)樣品在一定的檢驗(yàn)量和一定的檢驗(yàn)條件下無(wú)抗菌活性或抗菌活性在該條件下被消除到可以忽略不計(jì),盡可能地去除或者中和抗菌活性,以保證本檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠和檢驗(yàn)方法的完整度。實(shí)驗(yàn)參照《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則1105(微生物計(jì)數(shù)法)、1106(控制菌檢查法)[7]進(jìn)行試驗(yàn),以確定復(fù)方鮮竹瀝液的微生物限度檢查方案的完整建立[5-7]。

        2.1 實(shí)驗(yàn)方法

        樣品包含混勻的樣品原液和1∶10 供試液。取樣品10 mL,置錐形瓶中,加90 mL pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液混勻,作為1∶10 供試液。

        按如下公式計(jì)算加菌回收比值:

        2.1.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)法 試驗(yàn)組:取混勻的樣品原液9.9 mL 和1∶10 供試液9.9 mL,分別加入適宜濃度的試驗(yàn)菌液0.1 mL,混勻,使每1 mL 供試液中含菌量≤100 cfu。取1 mL 注入平皿,立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,置30~35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h~ 72 h,每隔24 h 觀察一次結(jié)果。供試品對(duì)照組:取上述制備好的原液和1∶10 供試液,以pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液,同試驗(yàn)組操作,測(cè)定供試品本底菌數(shù)。菌液對(duì)照組:取相應(yīng)pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液0.1 mL,混勻,后續(xù)操作同試驗(yàn)組。

        2.1.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)法 試驗(yàn)組:取混勻的樣品原液9.9 mL,加入適宜濃度的試驗(yàn)菌液0.1 mL,混勻,使每1 mL供試液中含菌量≤100 cfu。取1 mL注入平皿,立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,置20~25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h~120 h,每隔24 h 觀察一次結(jié)果。供試品對(duì)照組和菌液對(duì)照組參照“2.1.1”項(xiàng)下制備,培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,置20~25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h~120 h,每隔24 h 觀察一次結(jié)果。

        2.1.3 大腸埃希菌檢查法 試驗(yàn)組:取1∶10 供試液10 mL 加入100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,同時(shí)加入<100 cfu的大腸埃希菌液,置35 ℃培養(yǎng)18 h~24 h,取上述培養(yǎng)物1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中,42 ℃培養(yǎng)24~48 h 后取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上,35 ℃培養(yǎng)18~72 h,取麥康凱瓊脂平板上菌落經(jīng)純化后的培養(yǎng)物,接種至含5 mL 4-甲基傘形酮葡糖苷酸-蛋白胨培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng),分別于5 h、24 h 在366 nm 波段處紫外線下觀察,同時(shí)用未接種的4-甲基傘形酮葡糖苷酸-蛋白胨培養(yǎng)基作空白對(duì)照。觀察后,沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液再觀察。陰性對(duì)照組:取pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL 照大腸埃希菌檢查法操作。

        2.2 結(jié)果

        根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則1105(微生物計(jì)數(shù)法),需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法學(xué)驗(yàn)證需三次獨(dú)立平行的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果判定為回收比值均在0.5~2 之間;控制菌檢查方法為能有所加菌落的典型特征反應(yīng)來(lái)判定。

        9 批次復(fù)方鮮竹瀝液經(jīng)過(guò)驗(yàn)證:需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)在三次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中各種菌落的回收比值均在0.8~1.3 之間,符合《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則1105(微生物計(jì)數(shù)法)判定要求,見(jiàn)表1。大腸埃希菌檢查亦能見(jiàn)所加菌落的典型反應(yīng),見(jiàn)表2。

        表1 平行試驗(yàn)中菌落的回收比值

        表2 大腸埃希菌檢查法方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

        6 家企業(yè)的9 批次樣品,經(jīng)過(guò)試驗(yàn)最后確定微生物限度檢查法略有不同。

        其中8 批次樣品方法為:取樣品原液按平皿法(1 mL/皿),依法測(cè)定需氧菌總數(shù);取樣品原液按平皿法(1 mL/皿),依法測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù);取1∶10 供試液10 mL 至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,依法檢查大腸埃希菌。1 批次樣品方法為:取1∶10 供試液按平皿法(1 mL/皿),依法測(cè)定需氧菌總數(shù);取樣品原液按平皿法(1 mL/皿),依法測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù);取1∶10 供試液10 mL 至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,依法檢查大腸埃希菌。同一企業(yè)不同規(guī)格的樣品方法一致。結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 微生物限度檢查方法

        3 討論

        復(fù)方鮮竹瀝液為中藥液體口服制劑,其本身并無(wú)抑菌性,容易受微生物污染而導(dǎo)致藥物變質(zhì),處方中通常加有一定量抑菌劑以保持制劑在保質(zhì)期內(nèi)不受微生物入侵?!吨袊?guó)藥典》2020 年版一部收載的復(fù)方鮮竹瀝液制法中明確指出1 000 mL的復(fù)方鮮竹瀝液中加入3 g 苯甲酸鈉,抑菌劑濃度為0.3%。經(jīng)查閱企業(yè)的處方資料,6 家企業(yè)的復(fù)方鮮竹瀝液均加入一定量的抑菌劑苯甲酸鈉。復(fù)方鮮竹瀝液微生物限度檢查方法的略有不同有可能為企業(yè)制備時(shí)添加抑菌劑苯甲酸鈉的濃度不一致導(dǎo)致。

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品,微生物限度檢查法略有差異,體現(xiàn)在需氧菌總數(shù)檢查方面,兩種方法分別樣品原液和1∶10 供試液。方法的差異與復(fù)方鮮竹瀝液處方中加入的抑菌劑濃度有關(guān),與樣品的規(guī)格無(wú)關(guān)。

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