潘靜，楊人澤，鐘斌

贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000

苦竹為禾本科植物，常年生長(zhǎng)在山谷平原或向陽(yáng)山坡，在我國(guó)南方各省市分布廣泛，為竹資源中的優(yōu)良品種，苦竹用途廣泛［1］，竹筍、稈、皮、根等均已被開(kāi)發(fā)利用［2-3］，但苦竹葉多被廢棄。據(jù)《中藥大詞典》［4］中記載：苦竹葉有清熱治血、解毒消腫，治吐血、下血、小便不利、喉痹、癰腫等功能?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，苦竹葉含有大量的黃酮類化合物、多糖、生物堿、酚酸和揮發(fā)油、微量元素、氨基酸等成分［5-6］。多糖具有廣泛藥理活性：抗病毒、抗凝、抗炎、抗衰老、降血脂、降血糖、抗過(guò)敏、抗菌、免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤等［7］。隨著相關(guān)研究的增多，越來(lái)越多具有生物活性的多糖資源不斷被發(fā)現(xiàn)，但少見(jiàn)苦竹葉多糖抗腫瘤活性的報(bào)道，本研究提取精制苦竹葉多糖，并制成不同濃度樣品進(jìn)行抗腫瘤活性的研究，以期為苦竹葉資源的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，上海博迅）；CO2培養(yǎng)箱（Forma 311，美國(guó)Thermo）；倒置相差顯微鏡（CKX41，日本Olympus）；電子天平（SI-234，美國(guó)丹佛）；連續(xù)光譜多功能酶標(biāo)儀（Varioskan Flash，美國(guó) Thermo Fisher）。

1.2 藥物與試劑

苦竹葉采自贛州崇義竹林園，經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院中藥鑒定室鑒定；苦竹葉多糖（實(shí)驗(yàn)室自提）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma 公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco公司）。

1.3 細(xì)胞株

子宮頸癌HeLa 細(xì)胞，肺癌A549 細(xì)胞，人胃癌SGC7901 細(xì)胞，由贛南醫(yī)學(xué)院科研中心保藏提供。

2 方法

2.1 苦竹葉多糖制備

取苦竹葉粉末約200 g，用石油醚回流提取3 h，濾渣用無(wú)水乙醇回流1 h，脫色并除去小分子多糖，用40 倍原料質(zhì)量的中性水在溫度70 ℃條件下提取5 h，浸提2 次，然后按照 Sevage 法除去蛋白質(zhì)。分液后取上層液體加入75%乙醇，搖勻后靜置12 h 進(jìn)行醇沉，得粗多糖12 g。初步純化的苦竹葉多糖經(jīng) DEAE-32 離子柱層析，用0.1 mol/L NaCl 溶液進(jìn)行洗脫，收集相應(yīng)峰位組分，濃縮后，蒸餾水透析，冷凍干燥得到精制苦竹葉多糖8 g［8］。取苦竹葉多糖0.5 g，精密稱定，用二甲基亞砜（DMSO）溶解于10 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為50 g/L的苦竹葉多糖供試液，4 ℃冰箱保存，臨用前用培養(yǎng)液稀釋分別配制成不同濃度苦竹葉多糖50、100、200、400，600 μg/mL 以備實(shí)驗(yàn)用。

2.2 體外抗腫瘤活性測(cè)定

2.2.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件 宮頸癌 HeLa 細(xì)胞、肺癌A549 細(xì)胞及人胃癌細(xì)胞株7901 常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d 換液1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

2.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 細(xì)胞以 5×104/孔接種于96 孔板，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，次日細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度的（50、100、200、400、600 μg/mL）苦竹葉多糖培養(yǎng)液100 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)6 孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和以濃度為20 μg/mL的順鉑為陽(yáng)性對(duì)照組各6 孔，然后置 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24、36、48 h；取出后加入5 g/L的MTT 溶液 20 μL，37 ℃避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h；每孔加二甲基亞砜（DMSO）150 μL，震蕩10 min，混勻使甲瓚結(jié)晶充分溶解；置酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度（OD），取6 個(gè)復(fù)孔的均值為最終結(jié)果；計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=（空白對(duì)照組OD 值-多糖組OD 值）/空白對(duì)照組OD 值×100%［9］。采用lg C-抑制率回歸分析法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 15.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，抑制率值結(jié)果以表示，組間顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 苦竹葉多糖對(duì)子宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖的影響

苦竹葉多糖對(duì)子宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖的抑制率見(jiàn)表1，表1 是苦竹葉多糖干預(yù)48 h，濃度從50 μg/mL 增加到600 μg/mL 時(shí)，對(duì)子宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖的抑制率從5.10%升高到41.06%，干預(yù)72 h后,細(xì)胞增殖的抑制率從6.36%升高到45.52%，干預(yù)96 h 后，隨著給藥濃度的不斷增加其抑制作用不斷增強(qiáng)。苦竹葉多糖藥物作用96 h的IC50為491 μg/mL，均低于72 h、48 h的IC50值，說(shuō)明隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)子宮頸癌HeLa 細(xì)胞抑制作用越明顯。綜上所述，在測(cè)定范圍內(nèi)，苦竹葉多糖對(duì)子宮頸癌HeLa 細(xì)胞具有抑制作用，呈現(xiàn)出一定的劑量、時(shí)間依賴性，不同濃度的給藥組與空白對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同時(shí)間不同濃度的給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組相比較的結(jié)果如圖 1 所示。

表1 不同濃度的苦竹葉多糖對(duì)子宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響（n=6）

圖1 苦竹葉多糖和陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)子宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的比較

3.2 苦竹葉多糖對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖的影響

苦竹葉多糖對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖的抑制率見(jiàn)表2，表2 是當(dāng)苦竹葉多糖濃度為50 μg/mL，培養(yǎng)時(shí)間從48 h 增加至96 h，其細(xì)胞抑制率為0，而當(dāng)濃度提至100 μg/mL 時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間從48 h 增加至96 h，其細(xì)胞抑制率從0.85%增加至8.49%.濃度提至200 μg/mL 時(shí),其細(xì)胞抑制率從11.09%增加至19.18%.濃度增加至600 μg/mL 時(shí),其細(xì)胞抑制率從29.32%增加至46.65%?？嘀袢~多糖藥物作用72 h的IC50為684 μg/mL，低于48 h的IC50值，但與96 h的IC50值相差不大，說(shuō)明作用時(shí)間從48 h 延長(zhǎng)至72 h，其對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用明顯增加，但到72 h 后，抑制作用增加不明顯。綜上所述，在濃度達(dá)到100 μg/mL以上時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，苦竹葉多糖對(duì)肺癌A549 細(xì)胞具有抑制作用，呈現(xiàn)出一定的劑量、時(shí)間依賴性，不同濃度的給藥組與空白對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同時(shí)間不同濃度的給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組相比較的結(jié)果如圖2 所示。

表2 不同濃度的苦竹葉多糖對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響（n=6）

圖2 苦竹葉多糖和陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的比較

3.3 苦竹葉多糖對(duì)人胃癌SGC7901 細(xì)胞增殖的影響

苦竹葉多糖對(duì)人胃癌SGC7901 細(xì)胞增殖的抑制率見(jiàn)表3，表3 是苦竹葉多糖干預(yù)48 h，濃度從50 μg/mL 增加到600 μg/mL 對(duì)人胃癌SGC7901 細(xì)胞增殖的抑制率從6.02%升高到46.63%，給苦竹葉多糖72 h 后,細(xì)胞增殖的抑制率從9.85%升高到51.81%，給苦竹葉多糖96 h 后,隨著給藥濃度的不斷增加其抑制作用不斷增強(qiáng)，苦竹葉多糖藥物作用96 h的IC50為386 μg/mL，均低于72 h、48 h的IC50值，說(shuō)明隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用越明顯。綜上所述，測(cè)定范圍內(nèi)，苦竹葉多糖對(duì)人胃癌SGC7901 細(xì)胞具有抑制作用，呈現(xiàn)出一定的劑量、時(shí)間依賴性。不同濃度的給藥組與空白對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同時(shí)間不同濃度的給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組相比較的結(jié)果如圖3 所示。

表3 不同濃度的苦竹葉多糖對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的影響（n=6）

圖3 苦竹葉多糖和陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的比較

4 討論

苦竹葉多糖是苦竹葉的重要成分，魏琦等［10］證明苦竹葉化學(xué)成分分離得到的木犀草素-6-C 洋地黃毒糖苷-4'-O-葡萄糖苷對(duì)子宮頸癌HeLa細(xì)胞、肝癌HepG2 細(xì)胞及結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞有體外增殖抑制作用，以此為基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)提取精制苦竹葉多糖，以子宮頸癌HeLa 細(xì)胞、肺癌A549 細(xì)胞、人胃癌SGC7901 腫瘤細(xì)胞作為體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用MTT 法觀察苦竹葉多糖對(duì)3 種人惡性腫瘤細(xì)胞株的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦竹葉多糖在一定的濃度范圍內(nèi)，抑制作用較強(qiáng)且呈量效和時(shí)效關(guān)系，其中對(duì)人胃癌SGC7901 細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)，其次為子宮頸癌HeLa 細(xì)胞，最弱為肺癌A549 細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步將苦竹葉多糖開(kāi)發(fā)成一個(gè)新的抗腫瘤藥物提供了初步的依據(jù)，但其體內(nèi)抗腫瘤及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。