黃曉燕，李榮瑋，曾蒲軍，梁晟，李瑞蓮

湖南省藥品檢驗研究院，湖南 長沙 410001

十三味疏肝膠囊由牛黃、人工牛黃、西紅花、綠絨蒿、馬兜鈴等13 味藥材加工制成，具有清熱利濕、疏肝理脾、化瘀散結(jié)的功效,臨床上主要用于肝膽濕熱、氣滯血瘀所致的肋痛、脘脹，急慢性乙型肝炎見上述癥候者。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-11528（ZD-1528）-2002-2012Z。

近年來關(guān)于馬兜鈴屬植物引起腎毒性的臨床報道日益增多［1-4］，由于馬兜鈴酸具有腎毒性和致癌作用，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其確定為I 類致癌物。本品處方中的馬兜鈴為馬兜鈴科植物，含有馬兜鈴酸A等成分。目前尚未見十三味疏肝膠囊中馬兜鈴酸檢測的文獻(xiàn)報道,為了保證用藥安全性,本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)［5-12］，采用超高效液相色譜（UHPLC）建立了本品中馬兜鈴酸A的含量測定方法,并采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）對測定結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步的驗證，以為其質(zhì)量控制和臨床用藥安全提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子分析天平（METTLER XSE205）；超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，KQ500DE）；超高效液相色譜儀（Thermo Fisher Ultimate 3000 RS）；液質(zhì)聯(lián)用儀（DIONEX Ultimate 3000-TSQ ENDURA）。

1.2 試藥

馬兜鈴酸A（批號：110746-201611，純度98.9%），購自中國食品藥品檢定研究院。甲酸、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。十三味疏肝膠囊樣品為市售產(chǎn)品（批號：20170401、20180102-1、20180102-2）；陰性樣品按處方自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 UHPLC-PDA 法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為 Thermo Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），進(jìn)樣量為1 μL，柱溫為30 ℃，流動相為乙腈-0.5%冰醋酸（30∶70），流速為0.3 mL/min。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，混勻，取約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%甲酸-甲醇（20∶80）的混合溶液25 mL，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放涼，再稱定重量，用10%甲酸-甲醇（20∶80）的混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取馬兜鈴酸A 對照品16.85 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液（333.293 μg/mL），分別精密量取對照品貯備液適量，加甲醇稀釋成系列濃度對照品溶液（49.994、19.998、9.998、4.999、1.999 μg/mL）。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 取按樣品同樣工藝制備而成的缺馬兜鈴的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.1.5 專屬性試驗 精密吸取馬兜鈴酸A 對照品溶液（19.998 μg/mL）、陰性對照溶液與供試品溶液各1 μL，依法進(jìn)行測定。結(jié)果供試品色譜中，在與馬兜鈴酸A對照品色譜保留時間相同的位置上，有相應(yīng)色譜峰，而缺馬兜鈴陰性對照溶液無相應(yīng)色譜峰，表明處方中其它藥味對測定結(jié)果無干擾，專屬性強(qiáng)，結(jié)果見圖1。

圖1 十三味疏肝膠囊高效液相色譜圖

2.1.6 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號：20180102-1），連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次5 μL，結(jié)果馬兜鈴酸A 峰面積值RSD 為1.7%，精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號：20180102-1），分別于配制后的0、6、12、16、24 h，精密吸取5 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果馬兜鈴酸A 峰面積值RSD 為2.1%，表明供試品溶液在配制后24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗 取同一批號（批號：20180102-1）樣品6 份，依法制備供試品溶液，測定。結(jié)果馬兜鈴酸A的含量為0.12 mg/g（RSD 為1.2%），本方法重復(fù)性較好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取已知馬兜鈴酸A 含量（0.12 mg/g）的同一批樣品（批號：20180102-1）約0.75 g，共六份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入馬兜鈴酸A 對照品溶液（0.049 994 mg/mL）2 mL，水浴低溫蒸干，參照“2.1.2”項下的制備方法制備供試品溶液，測定并計算，結(jié)果見表1。結(jié)果馬兜鈴酸A 平均回收率為93.38%，RSD為1.35%，結(jié)果表明本方法加樣回收率較好。

表1 馬兜鈴酸A回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.1.10 線性關(guān)系 吸取馬兜鈴酸A 系列對照品溶液（49.994、19.998、9.998、4.999、1.999 μg/mL），依法測定。以馬兜鈴酸A的量為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果馬兜鈴酸A的回歸方程為Y=0.161 89X+0.002 73，r=0.999 9，結(jié)果表明馬兜鈴酸A 在1.999～49.994 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.11 測定結(jié)果 取十三味疏肝膠囊樣品，照“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，3 批樣品均檢出馬兜鈴酸A（批號：20170401，0.11 mg/g；批號：20180102-1，0.12 mg/g；批號：20180102-2，0.12 mg/g）。

2.2 LC-MS 法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Welch UHPLC XB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～7 min、30%→60% A，7～12 min、60%→100% A），柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：5 μL，流速：0.3 mL/min。

2.2.2 質(zhì)譜條件 m/z 范圍：100～1 000；離子化模式為ESI+，離子傳輸管溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓3.2 kV，干燥氣溫度350 ℃，碰撞能量10 V，鞘氣流速30 Arb，輔助氣流量10 Arb，掃描模式為MRM。

2.2.3 對照品溶液的制備 取“2.1.3”項下的馬兜鈴酸A 對照品溶液（1.999 μg/mL），即得。

2.2.4 供試品溶液的制備 取“2.1.2”項下的供試品溶液適量，用甲醇稀釋10 倍，作為供試品溶液。

2.2.5 測定法 精密吸取上述對照品溶液及供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。

圖2 十三味疏肝膠囊選擇離子色譜圖

2.3 測定結(jié)果

在 UHPLC-PDA 法中3 批樣品檢出含馬兜鈴酸A，采用LC-MS 法驗證，均檢出與對照品相同的分子離子峰及其碎片峰。

3 討論

3.1 樣品制備方法的選擇

采用了超聲處理、加熱回流2 種提取方法，結(jié)果二者提取得率基本相當(dāng)，因超聲提取操作簡便故選之。分別用甲醇、70%甲醇、10%甲酸-甲醇（20∶80）混合溶液各25 mL 超聲提取，結(jié)果表明，10%甲酸-甲醇（20∶80）混合溶液提取的待測成分得率稍高，故選擇10%甲酸-甲醇（20∶80）混合溶液為提取溶劑。

3.2 流動相的選擇

UHPLC-PDA 法測定時，考察了乙腈-0.5%冰醋酸（30∶70）、甲醇-0.5% 冰醋酸（48∶52）、乙腈-0.1%三氟乙酸（33∶67）、乙腈-0.1%磷酸（33∶67）、乙腈-0.1%甲酸（33∶67）五種流動相的分離效果，結(jié)果以乙腈-0.5%冰醋酸（30∶70）分離效果最好，故選之。

LC-MS/MS 法測定時，考察了10 mmol/L 醋酸銨溶液（氨水調(diào)pH 至7.5）-乙腈（75∶25）、0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脫）、含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸銨溶液-乙腈（梯度洗脫）三種流動相條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸銨溶液-乙腈為流動相，分子離子峰及加和離子峰響應(yīng)較好，故選之。

3.3 測定結(jié)果及分析

對3 批十三味疏肝膠囊樣品進(jìn)行檢驗，結(jié)果均檢出馬兜鈴酸A，提示本品可能存在一定的用藥安全風(fēng)險。

本文建立的UHPLC-PDA 法可準(zhǔn)確檢出十三味疏肝膠囊中含有的馬兜鈴酸A，與LC-MS 法的驗證結(jié)果一致。由此可見所建立的UHPLC-PDA 法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確、可靠，能有效地控制投料馬兜鈴藥材質(zhì)量，保障人民的用藥安全。