董勝君，王新鑫，張皓凱，陳建華，劉權(quán)鋼，徐 豪

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，沈陽(yáng)110161）

東北杏（Armeniacamandshurica）為薔薇科（Rosaceae）李亞科（Prunoideae）杏屬（Armeniaca）喬木，原產(chǎn)于遼寧、吉林[1]，在東北三省、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)及朝鮮半島北部均有分布。東北杏樹(shù)體高大，花果可賞，可做園林應(yīng)用；其根系發(fā)達(dá)，落葉豐富，抗逆性強(qiáng)，是東北地區(qū)營(yíng)建水源涵養(yǎng)林的優(yōu)良樹(shù)種；東北杏種仁的苦杏仁甙含量豐富，外用抗炎殺菌[2]，內(nèi)服鎮(zhèn)咳平喘[3]，藥用價(jià)值高；種仁含油率高于47%，且油脂脂肪酸組成及生物柴油燃料性能表現(xiàn)良好[4]，是極具開(kāi)發(fā)潛力的樹(shù)種，具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

目前，東北杏多數(shù)處于野生、半野生狀態(tài)[5]，分析其遺傳多樣性能為東北杏種質(zhì)資源的保護(hù)利用提供理論指導(dǎo)。利用分子標(biāo)記技術(shù)研究植物遺傳多樣性，相比表型性狀[6]而言，能夠直接反映遺傳物質(zhì)差異，且不受到季節(jié)、環(huán)境等因素影響。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、多態(tài)性、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析[7-11]。在杏屬植物中，SSR引物開(kāi)發(fā)成熟且通用性高，前人應(yīng)用SSR標(biāo)記對(duì)普通杏（PrunusarmeniacaL.）[12]、新疆野杏（ArmeniacavulgarisLam.）[13]、西伯利亞杏（Prunussibirica）[14]、梅（Prunusmume）[15]等進(jìn)行了遺傳多樣性分析，而東北杏的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。自然界中東北杏遺傳多樣性豐富，普遍存在種間雜交現(xiàn)象[16]，基于表型性狀鑒定東北杏種質(zhì)則存在一定的難度。應(yīng)用SSR標(biāo)記構(gòu)建的SSR指紋圖譜，具有高度個(gè)體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，能從分子水平上更為精確地鑒定種質(zhì)，已廣泛應(yīng)用在蘋(píng)果屬（MalusMill.）[17]、甜櫻桃（PrunusavinumL.）[18]、榴蓮（Duriozibethinus）[19]、無(wú)花果（FicuscaricaLinn.）[20]、油茶（CamelliaoleiferaAbel.）[21]等樹(shù)種的種質(zhì)鑒定中。

本研究以來(lái)自10個(gè)種源的61份東北杏種質(zhì)為試驗(yàn)材料，基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)東北杏的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討東北杏遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，并構(gòu)建東北杏SSR指紋圖譜，旨在為東北杏種質(zhì)資源的有效保護(hù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取東北杏自然地理分布區(qū)10個(gè)種源的61份東北杏種質(zhì)作為供試材料，遼寧省包括32份種質(zhì)，其中，丹東市3份，本溪市6份，撫順市6份，沈陽(yáng)市17份；吉林省包括17份種質(zhì)，其中，白山市3份，吉林市8份，延邊朝鮮族自治州6份；黑龍江省包括12份種質(zhì)，其中，牡丹江市4份，哈爾濱市5份，雞西市3份。具體地理位置信息見(jiàn)圖1。

圖1 61份東北杏種質(zhì)的地理分布Figure 1 Geographical distribution of 61 Armeniaca mandshurica germplasms

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及檢測(cè) 選用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒提取東北杏樣木陽(yáng)面1年生枝條上嫩葉的DNA。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA的質(zhì)量和濃度檢測(cè)后，置于-20℃冰箱中保存。依據(jù)課題組前期測(cè)序結(jié)果，由北京賽百盛生物工程有限公司合成600對(duì)SSR引物，從中選擇101對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的引物，并按照SSR-PCR反應(yīng)體系[22]進(jìn)行擴(kuò)增。利用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)固定、染色、漂洗、顯影等步驟后，置于凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，USA）中拍照記錄。

1.2.2 數(shù)據(jù)讀取與分析 利用Image Lab 4.0軟件讀取凝膠影像條帶，獲得原始基因型結(jié)果，并運(yùn)用DataTrans 2.0軟件轉(zhuǎn)換為基因型數(shù)據(jù)和“0”和“1”的矩陣。通過(guò)POPGENE 32軟件和CERVUS軟件計(jì)算遺傳參數(shù)。利用NTSYS2.10和MEGA 5.1軟件進(jìn)行種質(zhì)間和種源間的UPGMA聚類(lèi)分析,應(yīng)用NTSYS2.10軟件和GenAlEx 6.502軟件計(jì)算種質(zhì)間遺傳距離和地理距離，并進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)。利用ClusterProject軟件構(gòu)建種質(zhì)的指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析

利用101對(duì)引物對(duì)61份東北杏種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)表1。101個(gè)SSR位點(diǎn)的平均觀測(cè)等位基因?yàn)?.6436，有效等位基因比例在55.13%。等位基因數(shù)目存在差異，最多的有23個(gè)（位點(diǎn)Y109、P21），最少的有4個(gè)（位點(diǎn)X3H、X9H、X19H、X128、L62、Y44、Y48），且Na≥10有38對(duì)引物，Na≥15有16對(duì)引物，Na≥20有5對(duì)引物。不同位點(diǎn)的PIC變化范圍在0.5030～0.9250之間，平均值為0.7316，其中，PIC值最高的位點(diǎn)為P58H（0.9250），PIC值最低的位點(diǎn)為Y50（0.5030），各位點(diǎn)PIC值均高于0.5。61份東北杏種質(zhì)的平均Shannon信息指數(shù)高達(dá)1.7533，而平均觀測(cè)雜合度（0.2155）低于平均期望雜合度（0.7711）。

表1 東北杏101個(gè)位點(diǎn)遺傳多樣性參數(shù)Table 1 Genetic diversity parameters of 101 loci in Armeniaca mandshurica

續(xù)表

2.2 不同種源東北杏群體遺傳多樣性分析

供試東北杏種質(zhì)的10個(gè)種源遺傳多樣性參數(shù)見(jiàn)表2。平均Shannon信息指數(shù)為0.7431，平均觀測(cè)等位基因2.8307，有效等位基因占比為78.63%，平均觀測(cè)雜合度（0.2113）低于平均期望雜合度（0.4678）。遼寧省沈陽(yáng)市的東北杏遺傳多樣性最為豐富，各項(xiàng)指標(biāo)均為10個(gè)種源中的最大值（Na=5.0891，Ne=3.2249，I=1.2006，Ho=0.2353，He=0.6164），而遼寧省丹東市的遺傳多樣性水平最低。綜合各遺傳多樣性參數(shù)，10個(gè)種源的東北杏遺傳多樣性差異較大，其多樣性水平依次為：遼寧省沈陽(yáng)市＞吉林省吉林市＞遼寧省撫順市＞黑龍江省哈爾濱市＞吉林省延邊州＞黑龍江省牡丹江市＞遼寧省本溪市＞黑龍江省雞西市＞吉林省白山市＞遼寧省丹東市。

表2 東北杏10個(gè)種源遺傳多樣性參數(shù)Table 2 Genetic diversity parameters of 10 provenances of Armeniaca mandshurica

2.3 聚類(lèi)分析

2.3.1 東北杏種質(zhì)聚類(lèi)分析 利用101個(gè)SSR位點(diǎn)數(shù)據(jù)分析東北杏種質(zhì)的遺傳相似性，結(jié)果表明，遺傳相似系數(shù)平均值為0.8361，數(shù)值范圍在0.7482～0.9410。其中，704號(hào)和705號(hào)東北杏種質(zhì)遺傳相似度最高（94.10%），均來(lái)自于遼寧省本溪市，說(shuō)明二者之間的親緣關(guān)系較近；而來(lái)自黑龍江省牡丹江市的774號(hào)和來(lái)自遼寧省沈陽(yáng)市的725號(hào)東北杏種質(zhì)遺傳相似度最低（74.82%），說(shuō)明二者之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖2，遺傳相似系數(shù)0.842處可將所有種質(zhì)分為A、B、C、D共4類(lèi)。A類(lèi)、B類(lèi)的東北杏種質(zhì)來(lái)源均為遼寧省，其中，716號(hào)、717號(hào)、718號(hào)、719號(hào)、720號(hào)5個(gè)來(lái)自沈陽(yáng)市的種質(zhì)與遼寧省其他市的種質(zhì)聚為A類(lèi)，共20份種質(zhì)；沈陽(yáng)市內(nèi)其他種質(zhì)單獨(dú)聚為B類(lèi)，共12份種質(zhì)；C類(lèi)的東北杏種質(zhì)來(lái)源均為吉林省，共17份種質(zhì)；D類(lèi)的東北杏種質(zhì)來(lái)源均為黑龍江省，共12份種質(zhì)。

圖2 基于SSR標(biāo)記的東北杏UPGMA樹(shù)狀圖Figure 2 UPGMA dendritic map of Armeniaca mandshurica based on SSR markers

A類(lèi)在遺傳相似系數(shù)0.860處分成3個(gè)亞類(lèi)。A1亞類(lèi)共12個(gè)種質(zhì)，包括丹東市種質(zhì)、本溪市種質(zhì)和撫順市種質(zhì)（710號(hào)、711號(hào)、712號(hào)）；A2亞類(lèi)共4個(gè)種質(zhì)，包括撫順市種質(zhì)（713號(hào)、714號(hào)、715號(hào)）與沈陽(yáng)市的716號(hào)種質(zhì)；A3亞類(lèi)共4個(gè)種質(zhì)，均來(lái)自沈陽(yáng)市。

B類(lèi)在遺傳相似系數(shù)0.844處可進(jìn)一步分為兩個(gè)亞類(lèi)，721號(hào)、722號(hào)、723號(hào)、724號(hào)、725號(hào)5個(gè)種質(zhì)聚為B1亞類(lèi)；726號(hào)、732號(hào)、727號(hào)、728號(hào)、729號(hào)、730號(hào)、731號(hào)7個(gè)種質(zhì)聚為B2亞類(lèi)。

C類(lèi)在遺傳相似系數(shù)0.864處分為3個(gè)亞類(lèi)。C1亞類(lèi)共10個(gè)種質(zhì)，上支白山市種質(zhì)與吉林市種質(zhì)（744號(hào)、745號(hào)、746號(hào)）聚到一處，下支來(lái)自延邊朝鮮族自治州的748號(hào)、749號(hào)、750號(hào)種質(zhì)與吉林市種質(zhì)（747號(hào)）聚到一處；C2亞類(lèi)共5個(gè)種質(zhì)，延邊朝鮮族自治州的751號(hào)、752號(hào)、753號(hào)種質(zhì)與來(lái)自吉林市的755號(hào)、756號(hào)種質(zhì)聚到一處；C3亞類(lèi)包括吉林市的757號(hào)和758號(hào)種質(zhì)。

D類(lèi)在遺傳相似系數(shù)在0.862處劃分為3個(gè)亞類(lèi)。D1亞類(lèi)共4個(gè)種質(zhì)，均來(lái)自黑龍江省牡丹江市；D2亞類(lèi)共4個(gè)種質(zhì)，包括雞西市種質(zhì)和哈爾濱市種質(zhì)（776號(hào)）；D3亞類(lèi)共4個(gè)種質(zhì)，均為哈爾濱市種質(zhì)。

2.3.2 東北杏種源聚類(lèi)分析 基于10個(gè)種源間的遺傳距離矩陣做聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖3。在遺傳距離0.25處，可將其分為3類(lèi)（P1、P2、P3），體現(xiàn)了地理種源的分布特點(diǎn)。P1類(lèi)包括遼寧省的4個(gè)種源，其中，丹東市和本溪市親緣關(guān)系最近，然后與沈陽(yáng)市、撫順市聚為一類(lèi)；P2類(lèi)包括吉林省的3個(gè)種源，延邊朝鮮族自治州與吉林市親緣關(guān)系最近，后與白山市聚為一類(lèi)；P3類(lèi)包括黑龍江省的3個(gè)種源，牡丹江市、雞西市的親緣關(guān)系略近于哈爾濱市。

圖3 基于UPGMA法的東北杏種源聚類(lèi)圖Figure 3 UPGMA dendrogram for provenances of Armeniaca mandshurica

2.4 地理距離與遺傳距離的相關(guān)性

聚類(lèi)結(jié)果與東北杏種源高度吻合，經(jīng)計(jì)算東北杏種質(zhì)間的遺傳距離變化范圍為0.279～4.762，地理距離變化范圍為0.002～755.333km，Mantel檢驗(yàn)二者的相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)圖4。線性回歸方程為y=0.0035x+0.7606（R=0.752，p=0.010），說(shuō)明東北杏種質(zhì)的地理距離與遺傳距離之間存在顯著的相關(guān)性。

圖4 東北杏種質(zhì)間遺傳距離與地理距離間的相關(guān)性Figure 4 Correlation between genetic distance and geographic distance in Armeniaca mandshurica germplasms

2.5 東北杏SSR指紋圖譜構(gòu)建

按照PIC＞0.9的原則，從101對(duì)引物中篩選出8對(duì)引物，結(jié)合基因型數(shù)據(jù)、經(jīng)NTSYS2.10軟件聚類(lèi)分析驗(yàn)證，挑選出P58H（0.925）、L46（0.916）、L28H（0.903）3對(duì)引物。每對(duì)引物的區(qū)分能力不同，其中多態(tài)性最高的P58H引物僅能區(qū)分22份種質(zhì)，P58H和L46兩對(duì)引物組合能夠區(qū)分57份種質(zhì)，P58H、L46、L28H能區(qū)分全部的61份種質(zhì)，具體引物信息見(jiàn)表3。利用3對(duì)引物對(duì)61份東北杏種質(zhì)構(gòu)建的SSR指紋圖譜見(jiàn)圖5。

表3 3對(duì)SSR引物信息Table 3 The information of 3 pairs of SSR primer

圖5 61份東北杏種質(zhì)的SSR指紋圖譜Figure 5 SSR fingerprint of 61 Armeniaca mandshurica germplasms

3 討論與結(jié)論

每個(gè)等位基因相當(dāng)于一個(gè)具有不同重復(fù)單位拷貝數(shù)的DNA分子，位點(diǎn)的等位基因個(gè)數(shù)越多，意味著群體內(nèi)的基因型的數(shù)目越多[23]。本研究基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)61份東北杏種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行分析，觀測(cè)等位基因（Na）平均值為9.6436。有效等位基因（Ne）反映了群體的變異程度，等位基因在群體中分布越均勻，Ne越接近Na值[24]。東北杏群體中Ne占比為55.13%，說(shuō)明等位基因分布不均勻且存在稀有等位基因。101個(gè)位點(diǎn)的平均觀測(cè)雜合度（Ho=0.2155）低于平均期望雜合度（He=0.7711），說(shuō)明東北杏群體的雜合度不足，普遍存在近交衰退現(xiàn)象。Shannon信息指數(shù)（I）的平均值為1.7533，多態(tài)信息含量（PIC）的平均值為0.7316，變化范圍在0.5030～0.9250之間，說(shuō)明101個(gè)位點(diǎn)均為高度多態(tài)位點(diǎn)[25]。結(jié)合薔薇科樹(shù)種相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，認(rèn)為同屬內(nèi)東北杏的遺傳多樣性豐富度低于新疆野杏[13]、普通杏[12]，高于西伯利亞杏[14]、梅[15]；與同科樹(shù)種相比，東北杏的遺傳多樣性豐富度低于山荊子[Malusbaccata(L.)Borkh.][26]，高于長(zhǎng)柄扁桃（AmygdaluspedunculataPall.）[27]、西藏光核桃（Amygdalusmira）[28]、山櫻花[Cerasusserrulata(Lindley)Loudon][29]。

供試東北杏種源之間遺傳多樣性差異顯著，說(shuō)明東北杏的遺傳基礎(chǔ)豐富，但分布不均勻，以沈陽(yáng)市東北杏種質(zhì)的遺傳多樣性最為豐富（Na=5.0891，Ne=3.2249，I=1.2006，Ho=0.2353，He=0.6164）。此外，各種源雜合度普遍較低，且觀測(cè)雜合度（0.1832～0.2353）低于期望雜合度（0.2878～0.6164），說(shuō)明東北杏的近交衰退現(xiàn)象存在于各種源內(nèi)部，該結(jié)果為制定中國(guó)東北杏野生資源合理的保育策略提供了重要參考。

本研究供試的61份種質(zhì)來(lái)自10個(gè)不同種源，基本覆蓋東北杏的自然地理分布區(qū)域，具有一定代表性。在遺傳相似系數(shù)為0.842處可將東北杏種質(zhì)分為4類(lèi)，遼寧省內(nèi)種質(zhì)大多聚為A類(lèi)，僅沈陽(yáng)市部分種質(zhì)聚為B類(lèi)；吉林省內(nèi)種質(zhì)聚為C類(lèi)；黑龍江省內(nèi)種質(zhì)聚為D類(lèi)。對(duì)于東北杏的不同種源而言，在遺傳距離0.25處，可分為P1遼寧省種源、P2吉林省種源、P3黑龍江省種源3類(lèi)。聚類(lèi)結(jié)果表明，同一種源內(nèi)的種質(zhì)或者來(lái)自不同種源但地理距離較近的種質(zhì)存在較近的親緣關(guān)系。

地理隔離(IBD，isolation by distance)是指配子（如花粉）的擴(kuò)散因受到地理距離的限制而出現(xiàn)遺傳分化[30-31]?；谟邢薜幕蚪涣鞫a(chǎn)生顯著的遺傳差異，表現(xiàn)為隨地理距離增加，遺傳相似度隨之下降的現(xiàn)象[32]。通過(guò)Mantel檢驗(yàn)?zāi)軌蜻M(jìn)一步確定遺傳距離與地理距離之間是否存在線性相關(guān)性[33]。本研究中，地理距離與遺傳距離存在顯著的線性相關(guān)性（y=0.0035x+0.7606，R=0.752，p=0.010），表明東北杏存在IBD現(xiàn)象。杏屬植物中，西伯利亞杏[34]（R=0.453，p＜0.010）存在IBD現(xiàn)象；而普通杏[32]（p＞0.050）、野杏[13]（R=0.332，p=0.160）則不存在明顯的IBD現(xiàn)象。野生種群的遺傳變異模式復(fù)雜，本研究聚類(lèi)結(jié)果中存在與地理隔離不一致的個(gè)別現(xiàn)象，如來(lái)自哈爾濱市的776號(hào)與相距較遠(yuǎn)的雞西市種質(zhì)聚為D2亞類(lèi)，可見(jiàn)地理隔離不是影響東北杏種內(nèi)遺傳分化的唯一因素。以植物景觀遺傳學(xué)的角度，環(huán)境因子的空間分異、地形起伏、生境梯度都有可能影響植物內(nèi)部的遺傳分化[35]，可做進(jìn)一步研究調(diào)查，為東北杏種質(zhì)的遺傳多樣性保護(hù)提供依據(jù)。

SSR指紋圖譜在植物上最直接的應(yīng)用，就是品種鑒定以及對(duì)品種質(zhì)量和純度的檢測(cè)[36]。傳統(tǒng)林木鑒別以形態(tài)系統(tǒng)分類(lèi)法為主，而種內(nèi)不同種源、家系、無(wú)性系、品種間以及近緣種則從形態(tài)上較難區(qū)別，利用SSR指紋圖譜檢測(cè)到的一些在分子水平上的微小變異，能夠?qū)崿F(xiàn)遺傳鑒別[37]。本研究利用SSR位點(diǎn)的PIC值和基因型數(shù)據(jù)，篩選出3對(duì)引物（L46、P58H、L28H）構(gòu)建SSR指紋圖譜，將東北杏的部分遺傳信息圖像化，能夠完全區(qū)分61份東北杏種質(zhì)，還能對(duì)未知種源的東北杏種質(zhì)進(jìn)行種源鑒定。目前，普通杏[38]、西伯利亞杏[39]、梅[15]等杏屬植物均已構(gòu)建了SSR指紋圖譜，東北杏SSR指紋圖譜的補(bǔ)充，為杏屬植物的分類(lèi)鑒定和保護(hù)利用提供了有力支撐。

本研究開(kāi)展了基于SSR標(biāo)記的東北杏種質(zhì)的遺傳多樣性及其指紋圖譜構(gòu)建的研究，結(jié)果表明，東北杏具有豐富的遺傳多樣性，遼寧省沈陽(yáng)市的遺傳多樣性最高；地理種源對(duì)東北杏的分類(lèi)結(jié)果占據(jù)主導(dǎo)地位，地理距離與遺傳距離呈顯著相關(guān)，東北杏存在地理隔離現(xiàn)象；利用3對(duì)引物構(gòu)建了61份東北杏的SSR指紋圖譜，為東北杏種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)、保育研究及合理開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。