付雨涵，張 新，金芮冰，毛洪玉

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,沈陽110161）

隨著我國花卉事業(yè)不斷的發(fā)展，許多病害也在大面積傳播和蔓延，其中菊花白色銹病危害嚴(yán)重，傳播迅速，嚴(yán)重影響菊花的觀賞和生產(chǎn)價(jià)值[1-2]，利用基因工程技術(shù)改良菊花抗病性可有效解決菊花白色銹病的危害。WRKY蛋白參與生長(zhǎng)發(fā)育過程，如胚胎發(fā)生、毛狀體發(fā)育、衰老以及植物對(duì)各種生物和非生物脅迫的反應(yīng)，其在植物抗逆過程中起重要作用，被認(rèn)為是N端含有WRKYGQK組成的高度保守序列[3]。前期研究表明，WRKY是SA誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得抗性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要轉(zhuǎn)錄因子，NPR1也處于SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、植物病原菌互作通路的重要部分[4]。因此，在SA通路中WRKY可能依賴于NPR1起作用[5]。

有許多方法可以用來探索已知序列的側(cè)翼序列，如反向PCR[6]、TAIL-PCR[7-8]、接頭PCR[9]等。其中，TAILPCR操作簡(jiǎn)單、效率高并且對(duì)已知序列的要求少，所以這種方法被廣泛用于啟動(dòng)子的克隆、T-DNA插入位點(diǎn)的鑒定[10]。目前，通過改進(jìn)提出了一種更高效的HiTAIL-PCR，它可以抑制非特異產(chǎn)物和小片段的產(chǎn)生，并且通過試驗(yàn)成功率在90%以上[11]。

本課題組前期研究表明，CmWRKY15-1基因在菊花受堀氏菊柄銹菌侵染后上調(diào)表達(dá)，與菊花白色銹病的抗病性顯著相關(guān)，在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中，增強(qiáng)了植株的抗病性，而沉默植株中SA通路相關(guān)抗病基因的表達(dá)則受到了抑制[12-13]，但其分子機(jī)制還不清楚。因此，本研究通過HiTAIL-PCR技術(shù)克隆出CmWRKY15-1基因上游側(cè)翼序列，通過GUS染色和接菌處理表明CmWRKY15-1基因啟動(dòng)子具有很強(qiáng)病原菌誘導(dǎo)活性，并通過酵母單雜技術(shù)驗(yàn)證NPR1與CmWRKY15-1啟動(dòng)子之間的調(diào)控關(guān)系，為探究CmWRKY15-1的抗病機(jī)制提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊花抗病品種C029無菌苗由林學(xué)院組培室提供。植物表達(dá)載體pCAMBIA1301由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院孫曉梅教授惠贈(zèng)；La taq聚酶、10×Buffer II（MgCl2plus+）、dNTP、各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶及根癌農(nóng)桿菌EHA105均購于Takara公司；克隆載體pEASY-T1 SimpleCloning Kit和感受態(tài)細(xì)胞Trans-T1 Phage Chemically Competent Cell購于萬澤有限公司。

酵母單雜所用誘餌載體pAbAi、獵物載體pGADT7購于淼靈質(zhì)粒平臺(tái)；Y1H Gold酵母感受態(tài)購于北京梓熙有限公司；金擔(dān)子素及各種培養(yǎng)基購于酷萊博有限公司；Matchmaker Insert Check PCRMix 1購于Takara公司。

1.2 CmWRKY15-1啟動(dòng)子的克隆及生物信息學(xué)分析

利用HiTAIL-PCR技術(shù)步移CmWRKY15-1啟動(dòng)子序列，根據(jù)YAO等[11]設(shè)計(jì)側(cè)翼引物（表1），HiTAIL-PCR分為3輪擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增、第1輪PCR、第2輪PCR。將最后一輪PCR產(chǎn)物連入克隆載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測(cè)序驗(yàn)證。將獲得的序列通過Plant CARE和PLACE軟件進(jìn)行分析[14-15]。

表1 CmWRKY15-1啟動(dòng)子序列擴(kuò)增引物及載體構(gòu)建所需引物Table 1 Primers for CmWRKY15-1 promoter amplification and vector construction

1.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以菊花C029為模板，設(shè)計(jì)3對(duì)啟動(dòng)子5’端缺失的短截體引物（表1），分別為677bp、1182bp、1485bp。利用PCR將上述CmWRKY15-1基因啟動(dòng)子上游引入KpnI，下游引入NcoI。然后，通過T4連接酶將其連入用KpnI/NcoI酶切后的pCAMBIA1301骨架上，構(gòu)建CmWRKY15-1啟動(dòng)子控制GUS報(bào)告基因表達(dá)的表達(dá)載體，命名為pCmWRKY15-1::GUS-1、pCmWRKY15-1::GUS-2、pCmWRKY15-1::GUS-3。然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將三個(gè)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌中，菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.4 菊花C029的瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化

菊花C029的瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化參照高歌等[16]的方法進(jìn)行。將含有pCmWRKY15-1::GUS-1、pCmWRKY15-1::GUS-2、pCmWRKY15-1::GUS-3質(zhì)粒的農(nóng)桿菌培養(yǎng)到OD600=0.8～1.0，用離心后收集的菌體重懸制備侵染液（1mmol·L-1MgCl2，10mmol·L-1MES，200μmol·L-1AS)，用此菌液侵染菊花C029的組培苗60min，后暗培養(yǎng)3d，鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.5 GUS組織化學(xué)染色

將鑒定后的轉(zhuǎn)基因植株，在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)后山林學(xué)院基地進(jìn)行接菌處理，分別在病原菌誘導(dǎo)0，24，48，72h對(duì)菊花葉片進(jìn)行GUS染色，37℃浸泡過夜。然后用無水乙醇對(duì)其脫色，更換2～3次直到葉片完全脫色，并進(jìn)行觀察拍照。

1.6 誘餌載體的構(gòu)建

將CmWRKY15-1基因啟動(dòng)子序列分為兩段，分別構(gòu)建誘餌載體。根據(jù)啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物（表2），利用PCR將兩段啟動(dòng)子上游引入SacI，下游引入Xhol。然后將其分別插入SacI/Xhol酶切過后的pABAi載體骨架上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，陽性克隆送測(cè)。將其命名為pCmWRKY15-1-AbAi-1、pCmWRKY15-1-AbAi-2。

1.7 Y1HGold酵母菌株的構(gòu)建

用BstBI單酶切pCmWRKY15-1-AbAi-1、pCmWRKY15-1-AbAi-2及陽性對(duì)照質(zhì)粒p53-AbAi。把線性化的載體分別轉(zhuǎn)入Y1HGold酵母感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂在SD/-Ura缺陷培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3～5d。待長(zhǎng)出菌落后，挑取少量用Matchmaker Insert Check PCR Mix1進(jìn)行陽性菌落的鑒定。

1.8 誘餌酵母中報(bào)告基因本底表達(dá)水平的測(cè)定

在SD/-Ura缺陷培養(yǎng)基上挑取pCmWRKY15-1-AbAi-1、pCmWRKY15-1-AbAi-2誘餌克隆和陽性對(duì)照克隆，分別加入0.9%NaCl中進(jìn)行重懸并稀釋OD600到0.002。把稀釋好的菌液涂布在ABA濃度為0，100，200，500ng·mL-1的SD/-Ura缺陷培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3～5d。

1.9獵物載體p GADT7-CmNPR1的構(gòu)建

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[13]設(shè)計(jì)引物（表1），利用PCR將CmNPR1上游引入BamHI，下游引入EcoRI。然后將其分別插入BamHI/EcoRI酶切過后的pGADT7載體骨架上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，陽性克隆送測(cè)。

1.10 p GADT7-NPR1獵物載體共轉(zhuǎn)化入誘餌菌株制作的感受態(tài)

將p53-AbAi空載，pCmWRKY15-1-AbAi-1與pCmWRKY15-1-AbAi-2制作成感受態(tài)，然后將獵物載體pGADT7-CmNPR1通過共轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入誘餌菌株制作的感受態(tài)，將轉(zhuǎn)化好的菌液涂布在SD/-Leu固體培養(yǎng)基上（ABA濃度為200ng·mL-1），30℃倒置培養(yǎng)3～5d。

2 結(jié)果與分析

2.1 CmWRKY15-1基因上游啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增

根據(jù)CmWRKY15-1的DNA序列設(shè)計(jì)3條特異性引物與4條通用引物進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增。第1輪預(yù)擴(kuò)增4對(duì)引物均無條帶，第2輪、第3輪擴(kuò)增只有mLAD3引物有清晰的條帶，且條帶位置符合3rd PCR產(chǎn)物比2nd PCR產(chǎn)物稍短（圖1）。將第3輪mLAD3引物擴(kuò)增的條帶進(jìn)行切膠回收，膠回收后與pEASY-T1 Simple Cloning Kit連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，挑選陽性克隆，均測(cè)序成功。

圖1 HiTAIL-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Figure 1 The amplification product of HiTALL-PCR

2.2 CmWRKY15-1啟動(dòng)子的順式作用元件分析

通過HiTAIL-PCR的方法得到了CmWRKY15-1的啟動(dòng)子序列1485bp，通過軟件分析，其中除了含有CAAT-box和TATA-box啟動(dòng)子必備核心元件、脫落酸響應(yīng)元件ABRE、MYB識(shí)別元件等，還包含了許多與植物抗逆有關(guān)重要元件如病原菌誘導(dǎo)元件W-box、GT1-motif、防御應(yīng)激元件TC-rich repeats、SA誘導(dǎo)元件As1/ocs（圖2），這說明CmWRKY15-1基因在逆境脅迫中可以發(fā)揮作用，并且響應(yīng)病原菌的誘導(dǎo)。

圖2 CmWRKY15-1基因啟動(dòng)子作用元件分析Figure 2 The cis-acting element analysis of CmWRKY15-1 gene promoter

2.3 CmWRKY15-1啟動(dòng)子控制GUS基因的表達(dá)載體構(gòu)建

以菊花C029的DNA序列為模板，克隆CmWRKY15-1基因啟動(dòng)子3段5’端缺失短截體，分別為677，1182，1485bp（圖3）。用這3段啟動(dòng)子序列分別替換pCAMBIA1301的35S啟動(dòng)子序列，構(gòu)建pCmWRKY15-1::GUS-1、pCmWRKY15-1::GUS-2和pCmWRKY15-1::GUS-3植物表達(dá)載體。

圖3 CmWRKY15-1基因啟動(dòng)子序列3段的5’端短截體Figure 3 The 5′-end short truncation of the three segments of the promoter sequence of CmWRKY15-1 gene

2.4 CmWRKY15-1啟動(dòng)子的表達(dá)分析

利用瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化的方法將pCmWRKY15-1::GUS-1、pCmWRKY15-1::GUS-2和pCmWRKY15-1::GUS-3這3個(gè)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到菊花C029上，分別獲得了3種轉(zhuǎn)基因植株。當(dāng)病原菌誘導(dǎo)0h時(shí)，用GUS染色液對(duì)這3種轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行染色，可以看出基本沒有藍(lán)色出現(xiàn)；當(dāng)病原菌誘導(dǎo)48h時(shí)，葉片上的藍(lán)色面積最大且顏色深，而72h時(shí)藍(lán)色變淺。說明在病原菌誘導(dǎo)48h時(shí)，啟動(dòng)子的活性最高（圖4）。還可以看出，pCmWRKY15-1::GUS-3轉(zhuǎn)基因植株無論在哪個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)色都最多，其次是pCmWRKY15-1::GUS-2，最少的是pCmWRKY15-1::GUS-1，這說明啟動(dòng)子越長(zhǎng)，活性越大。在病原菌誘導(dǎo)前后，菊花野生型葉片均沒有藍(lán)色出現(xiàn)。

圖4 CmWRKY15-1啟動(dòng)子病原菌誘導(dǎo)表達(dá)特性的GUS組織化學(xué)染色分析Figure 4 GUShistochemical staining analysis of CmWRKY15-1 promoter pathogenic bacteria inducible expression characteristics

2.5 誘餌酵母菌株的獲得

將CmWRKY15-1啟動(dòng)子根據(jù)所含順式作用元件分為兩部分，以菊花C029 DNA為模板，克隆出677bp和808bp的條帶，將其分別構(gòu)建誘餌載體。將構(gòu)建好的誘餌載體分別用SacI和Xhol進(jìn)行雙酶切，分別得到兩條與預(yù)期相符的條帶（圖5A和圖5B），且測(cè)序結(jié)果與CmWRKY15-1啟動(dòng)子比對(duì)相同，說明誘餌載體pCmWRKY15-1-AbAi-1、pCmWRKY15-1-AbAi-2構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的誘餌載體用BstBI進(jìn)行線性化，膠回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Y1HGold酵母感受態(tài)中，吸取100μL的菌液在SD/-Ura的缺陷培養(yǎng)基上涂板，30℃培養(yǎng)3～5d，并對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。由圖5C可知，對(duì)轉(zhuǎn)入片段為677bp啟動(dòng)子序列的酵母菌株進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果為1.35kb＋677bp，即2027bp；轉(zhuǎn)入片段為808bp啟動(dòng)子序列的菌落PCR結(jié)果為1.35kb＋808bp，即2158bp，這表明成功獲得誘餌酵母菌株。

圖5 誘餌載體酶切鑒定及誘餌菌株P(guān)CR鑒定Figure 5 identification of Bait Vector by restriction enzyme digestion and identification of Bait strain by PCR

2.6 金擔(dān)子素的抗性篩選

挑取上述兩種菌株的陽性酵母菌落，用0.9%NaCl液體重懸細(xì)胞，直至OD600到0.002。將重懸后的菌液涂布在ABA濃度達(dá)到200ng·mL-1的培養(yǎng)基上時(shí)，無菌落長(zhǎng)出，可以徹底抑制酵母菌株的生長(zhǎng)（圖6），所以后續(xù)互作試驗(yàn)時(shí)金擔(dān)子素的濃度為200ng·mL-1。

圖6 本底水平表達(dá)Figure 6 Background level expression

2.7 獵物載體的構(gòu)建

以菊花C029的cDNA為模板，克隆出CmNPR1基因序列1600bp，插入pGADT7載體上，構(gòu)建pGADT7-CmNPR1獵物載體。將構(gòu)建好的獵物載體重組質(zhì)粒用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切后獲得1600bp的小片段和約5700bp的大片段（圖7），且測(cè)序結(jié)果與CmNPR1的目的序列相符合，說明獵物載體pGADT7-CmNPR1構(gòu)建成功。

圖7 獵物載體酶切鑒定Figure 7 Restriction digestion identification of prey vector

2.8 CmNPR1與CmWRKY15-1啟動(dòng)子之間的調(diào)控關(guān)系

將獵物載體pGADT7-NPR1共轉(zhuǎn)化入pCmWRKY15-1-AbAi-1與pCmWRKY15-1-AbAi-2及陽性對(duì)照誘餌菌株中在含有200ng·mL-1ABA的SD/-Leu培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3～5d后pCmWRKY15-1-AbAi-1與pCmWRKY15-1-AbAi-2與獵物載體共轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基均有菌落長(zhǎng)出（圖8），這表明CmNPR1與CmWRKY15-1啟動(dòng)子之間存在調(diào)控關(guān)系。

圖8 誘餌載體與獵物載體共轉(zhuǎn)化示意圖Figure8 Co-transformation of bait vector and prey vector

3 討論與結(jié)論

由堀氏菊柄銹菌引起的菊花白色銹病是在世界范圍內(nèi)危害菊花最嚴(yán)重的病害之一，其最經(jīng)濟(jì)有效的防治方法就是發(fā)掘抗性基因、培育抗性品種[17-18]。越來越多的研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物受到各種脅迫的環(huán)境中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以通過復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)在SA、JA等通路上調(diào)節(jié)多種生物功能，包括病原體觸發(fā)免疫的受體、特異性相互作用的染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑和信號(hào)傳遞等[19-21]。前期研究表明CmWRKY15-1通過影響SA信號(hào)在菊花抗白色銹病中起重要作用，是一個(gè)正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，并且我們通過RNA-Seq獲得差異表達(dá)基因NPR1，它是SA通路上一個(gè)重要的候選基因，在對(duì)CmWRKY15-1沉默后NPR1的轉(zhuǎn)錄水平也顯著降低[12-13]。

HiTAIL-PCR技術(shù)與傳統(tǒng)的TAIL-PCR相比獲得的片段特異性更高且都是大片段，成功率達(dá)到了90%以上，現(xiàn)應(yīng)用也更加廣泛[22-23]，陳紅運(yùn)等[24]通過HiTAIL-PCR技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因木瓜的側(cè)翼序列，張順倉[25]通過熱不對(duì)稱PCR克隆了木聚糖酶基因。本研究通過HiTAIL-PCR技術(shù)克隆了CmWRKY15-1的啟動(dòng)子，通過軟件分析在CmWRKY15-1的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與NPR1互作的SA誘導(dǎo)元件As1/ocs[26-28]，GUS染色可以看出CmWRKY15-1啟動(dòng)子有很強(qiáng)的病原菌誘導(dǎo)活性，這些結(jié)果表明NPR1可能通過結(jié)合CmWRKY15-1的啟動(dòng)子來激活其表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)，NPR1可以通過與WRKY基因啟動(dòng)子的相互作用來激活下游抗病基因的表達(dá)[29-30]，CHUN等[31]發(fā)現(xiàn)，AtWRKY18是通過調(diào)節(jié)抗病蛋白NPR1/NIM1增強(qiáng)發(fā)育調(diào)節(jié)的防御反應(yīng)。因此，本試驗(yàn)把含有CmWRKY15-1啟動(dòng)子誘餌載體的酵母菌株與NPR1獵物載體共轉(zhuǎn)化，酵母單雜結(jié)果表明NPR1可以結(jié)合CmWRKY15-1啟動(dòng)子序列，參與防御菊花白色銹病的過程，但CmWRKY15-1與NPR1是否在蛋白水平上相互作用仍需要進(jìn)一步的試驗(yàn)探究。