周洲 張東寧 房程龍 朱崇田 陸玉成

(1 青島大學第十一臨床醫(yī)學院(臨沂市人民醫(yī)院)，山東 臨沂 276003；2 臨沂市人民醫(yī)院康復診療中心； 3 臨沂市人民醫(yī)院中心實驗室)

腦膠質瘤起源于神經(jīng)膠質細胞，是顱內最常見的原發(fā)性腫瘤，發(fā)病率占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的81%[1]。腦膠質瘤分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級，其中Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質瘤，腦膠質瘤級別越高，預后越差。高級別膠質瘤，尤其膠質母細胞瘤，具有高侵襲性、高復發(fā)率、高死亡率的特點，患者預后極差，5年生存率約為5.6%[1-4]。迄今為止，腦膠質瘤的治療方法有手術切除、化療、放療、生物治療及免疫治療等。由于腦膠質瘤具有廣泛侵襲的生物學特性，與周圍組織邊界不清，手術無法完全切除，復發(fā)率較高[5-7]。而輔助放療和化療技術，治療效果也不盡人意[8-9]。此外，因腦膠質瘤的遺傳異質性，新提出的免疫治療和生物治療對患者的生存率也無明顯的影響[10]。因此，研究新的有效治療方法是當務之急。磷酸甘油酸變位酶1(PGAM1)是糖酵解的重要酶，催化3-磷酸甘油酸(3-PG)生成2-PG，通過控制細胞內底物3-PG和產(chǎn)物2-PG的濃度反饋調控生物大分子物質的合成，在腫瘤的代謝和生物合成過程中發(fā)揮著重要作用[11]。研究證實PGAM1在人類多種腫瘤組織中表達上調，而且其表達水平與非小細胞肺癌、乳腺癌、宮頸癌、口腔鱗狀細胞癌等患者的預后呈顯著負相關[12-15]。Ki67是應用較廣泛的細胞增殖標志物，存在于細胞核內，與細胞周期密切相關。目前研究發(fā)現(xiàn)隨著腦膠質瘤病理級別的增高，Ki67蛋白的表達水平也逐漸增高[16]。目前國內外分別有PGAM1和Ki67在腦膠質瘤組織中表達的研究，但是關于PGAM1與Ki67在腦膠質瘤中的表達是否具有相關性及其具體調控機制尚未見相關報道。本研究應用免疫組織化學方法檢測腦膠質瘤組織中PGAM1和Ki67表達水平，探討兩者的相關性及其與患者臨床病理特征的關系，為尋找腦膠質瘤新的檢測標志物及治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取2014年1月—2018年12月于臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)外科行手術治療并經(jīng)病理檢查確診為腦膠質瘤的83例患者腫瘤組織標本(腦膠質瘤組)，同時選取10例來自于接受顱內減壓手術的顱腦外傷或高血壓腦出血患者的腦組織樣本。腦膠質瘤組中男41例，女42例；年齡4～82歲，平均年齡48歲；按照WHO(2007年)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病理分級標準，將腦膠質瘤組分為Ⅰ～Ⅱ級組26例，Ⅲ級組21例，Ⅳ級組36例。所有腦膠質瘤患者術前均未接受過放射化學治療。本研究經(jīng)過臨沂市人民醫(yī)院倫理委員會批準，患者或其親屬術前均簽署知情同意書。

1.2 蘇木精-伊紅(HE)和免疫組織化學染色

術中收集的腦組織標本，常規(guī)石蠟包埋后，切片。按照常規(guī)方法進行HE染色，在光鏡下觀察組織標本的病理變化情況。免疫組織化學染色操作嚴格按照中杉免疫組化試劑盒(PV9003)說明書進行，一抗為PGAM1(1∶200，ab2220，美國Abcam公司)、Ki-67(1∶100，上海復申生物科技有限公司)，檢測兩組中PGAM1和Ki-67蛋白的表達情況。

1.3 結果的判讀標準

針對兩種染色結果均采用雙盲法進行觀察。其中免疫組織化學染色結果的判讀參考相關文獻標準[17]，以細胞質內呈黃色或棕黃色為PGAM1陽性表達，細胞核出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒為Ki67陽性表達。PGAM1綜合評分包括細胞染色比例以及細胞染色強度兩部分，細胞染色比例為染色細胞在細胞總數(shù)中所占的比例，分為0、1%～25%、26%～50%、51%～75%和>75% 5個等級，分別計為0、1、2、3和4分；細胞染色強度分為無、弱、中、強4個等級，分別計為0、1、2和3分。按照細胞染色比例和染色強度得分的乘積進行分組，乘積的分值≤3分為PGAM1低表達組，>3分為PGAM1高表達組；用陽性指數(shù)評估Ki67蛋白的表達情況并進行分組，陽性指數(shù)≥10%為Ki67高表達組，陽性指數(shù)<10%為Ki67低表達組。

1.4 腦膠質瘤組患者臨床資料的收集以及患者的隨訪

收集腦膠質瘤組患者的臨床資料，包括患者的性別、年齡及腫瘤原發(fā)位置。對腦膠質瘤患者本人或家屬以電話、門診方式進行隨訪，隨訪截至患者病逝或隨訪結束。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率(X%)表示，計量資料以M(P25，P75)表示，腦膠質瘤組織中PGAM1、Ki67蛋白表達水平比較，及與各臨床病理參數(shù)分析采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗。PGAM1高表達以及低表達組間Ki67蛋白的表達比較采用Mann-Whitney檢驗。同時采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，以Log-rank檢驗分析PGAM1和Ki67蛋白的表達與腦膠質瘤患者生存的相關性。以P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結 果

2.1 各組腦組織HE染色結果

對照組腦組織細胞密度均勻，層次分明，細胞核規(guī)則，胞漿無異常染色，無異型性細胞(圖1A)；腦膠質瘤Ⅰ～Ⅱ級組患者的腦膠質瘤細胞密度增加，細胞質著色，細胞核深染，輕度異型性(圖1B)；Ⅲ級組患者腦膠質瘤細胞聚集，大小不一，排列紊亂，異型性更加明顯(圖1C)；Ⅳ級組患者腦膠質瘤細胞明顯密集，核分裂象多見，可見微血管增生(圖1D)。

A～D分別為對照組、Ⅰ～Ⅱ級組、Ⅲ級組、Ⅳ級組，PV9003法，200倍

2.2 PGAM1和Ki67在各組腦組織中的表達情況比較

免疫組織化學染色結果顯示,PGAM1主要表達于細胞質中，Ki67定位于細胞核內。對照組和不同級別腦膠質瘤組中PGAM1表達比較差異有顯著性(χ2=21.029，P<0.05)。不同級別腦膠質瘤組中Ki67表達比較，差異具有顯著性(χ2=28.105，P<0.05)。見表1。

表1 PGAM1和Ki67在各組腦組織中表達情況比較(例)

2.3 腦膠質瘤組織中PGAM1、Ki67蛋白的表達與患者臨床病理特征的關系

根據(jù)免疫組化染色結果，PGAM1高表達組患者42例，PGAM1低表達組患者41例；Ki67高表達組患者57例，Ki67低表達組患者26例。高級別(WHO Ⅲ～Ⅳ級)腦膠質瘤組織中PGAM1以及Ki67蛋白的表達顯著高于低級別(WHO Ⅰ～Ⅱ級)腦膠質瘤組織(χ2=14.906、20.415，P<0.05)，而與患者性別、年齡以及腫瘤原發(fā)位置無關(P>0.05)。見表2。

表2 PGAM1和Ki67表達水平與患者臨床病理特征的關系

2.4 腦膠質瘤組織中PGAM1以及Ki67表達的相關性

PGAM1高表達組和低表達組的Ki67陽性指數(shù)分別為5.0(0.0～15.0)、10.0(5.0～30.0)，兩組間比較差異具有顯著性(Z=-3.038，P<0.05)。

2.5 PGAM1和Ki67表達與腦膠質瘤患者生存時間的關系

Kaplan-Meier曲線顯示，PGAM1與Ki67高表達、低表達組患者總生存期比較差異有顯著性(P<0.05)。見圖2。

圖2 PGAM1和Ki67高表達、低表達組患者的生存曲線圖

3 討 論

腦組織主要依靠葡萄糖提供能量，在氧氣充足時，葡萄糖經(jīng)過氧化磷酸化產(chǎn)生大量的能量，并進行物質代謝，參與一系列細胞活動。在缺氧環(huán)境下，氧化磷酸化被抑制，腦組織細胞只能通過糖酵解產(chǎn)生能量供能。然而早期的研究發(fā)現(xiàn)，即使在氧氣充足的條件下，一些細胞依然選擇糖酵解途徑進行能量代謝，經(jīng)糖酵解代謝產(chǎn)生的丙酮酸并不進入線粒體進行氧化磷酸化，反而在細胞質內經(jīng)代謝生成乳酸，這一現(xiàn)象被稱為“有氧糖酵解”，也叫“Warburg效應”[18]。研究證實，Warburg效應是腫瘤的生物學特征，對腫瘤內Warburg效應的分子機制進行研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞糖酵解途徑中的幾種關鍵酶含量明顯上升，通過調控細胞的能量和物質代謝來促進腫瘤的生長、浸潤及轉移[19-20]。

PGAM1為輔因子依賴型的單磷酸甘油酸變位酶，在糖酵解和磷酸戊糖途徑中起著關鍵性作用。PGAM1由2個相對分子質量為30 000的亞單位B(腦型)組成的同二聚體，即BB-PGAM，最初在腦組織中被發(fā)現(xiàn)，后來證實在人類組織中廣泛表達。多項研究表明，PGAM1在腫瘤組織中高表達，其表達水平與惡性腫瘤的臨床分期以及預后有明顯的相關性[15]。ZHANG等[15]發(fā)現(xiàn)PGAM1的表達與口腔鱗狀細胞癌患者的淋巴結轉移、腫瘤復發(fā)相關，且PGAM1是患者總體生存率(OS)和無病生存(DFS)的獨立風險因素。LIU等[21]將PGAM1的表達程度與胰腺導管腺癌患者是否有腫瘤遠處轉移、組織分化程度、臨床分期以及生存率的關系進行分析，結果表明，PGAM1表達水平越高，癌組織的分化程度越高，臨床分期越高，患者的生存率越低，且遠處轉移的傾向性越高。PGAM1具有代謝酶和非代謝酶的雙重作用。mTOR/HIF-1α通路可以轉錄激活PGAM1，活化的PGAM1通過其代謝酶作用促進Warburg效應，促使細胞增殖和腫瘤生長[12]。敲低乳腺癌細胞內PGAM1的表達后，底物3-PG累積，可競爭性結合磷酸戊糖途徑的關鍵酶6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-PGD)，致使DNA的合成原料dNTP失衡，激活下游p53(p73)并作用于p21，后者可使APC/C-Cdh1復合物活化，導致DNA的同源修復(HR)過程失敗，從而抑制腫瘤細胞的增殖[13]。此外，PGAM1通過其非代謝酶與α-平滑肌肌動蛋白(ACTA2)相互作用，在腫瘤的進展中起著關鍵作用[22]。最近，國內首先報道了PGAM1的一種新型變構抑制劑HKB99，具有抑制PGAM1代謝酶和非代謝酶活性的雙重作用，進而抑制細胞的增殖和遷移[23]。PGAM1已成為腫瘤診斷與治療的熱點。

Ki67是一種細胞增殖相關蛋白，存在于除G0期之外的細胞周期中。在病理學中，Ki67陽性指數(shù)和有絲分裂指數(shù)可作為腫瘤組織病理學分級的指標[24]。Ki67在許多腫瘤中異常表達，可作為腫瘤復發(fā)的重要預后指標[25]。研究發(fā)現(xiàn)Ki67在腦膠質瘤組織中異常高表達，與腦膠質瘤的惡性程度和預后密切相關[26]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，下調PGAM1表達后可導致細胞周期阻滯，抑制腫瘤細胞增殖，提示PGAM1可能在細胞周期的調控過程中發(fā)揮著重要作用。JUNG等[27]將可以通過血-腦屏障的Tat-PGAM1融合蛋白經(jīng)腹腔注射到8周齡的雄鼠體內，3周后取其腦組織進行免疫組織化學檢測，發(fā)現(xiàn)在Tat-PGAM1組下丘腦齒狀回細胞內Ki67陽性增殖細胞數(shù)量和陽性核表達顯著增加。REN等[28]也報道在肝癌的荷瘤小鼠中敲低PGAM1的表達后，Ki67陽性表達下降68%以上。但是，關于腦膠質瘤中PGAM1與Ki67表達的相關性及其意義的研究尚未見報道。

本研究結果顯示，腦膠質瘤組織中PGAM1的表達明顯高于對照組正常腦組織，高級別(WHO Ⅲ～Ⅳ)腦膠質瘤組織中的表達較低級別(WHO Ⅰ～Ⅱ)腦膠質瘤組織明顯增高，這與先前的研究結果一致[29-30]。隨著腦膠質瘤病理級別增高，Ki67蛋白的表達水平也逐漸升高，高級別(WHO Ⅲ～Ⅳ)腦膠質瘤組織中Ki67蛋白的表達水平顯著高于低級別(WHO Ⅰ～Ⅱ)腦膠質瘤組織。將PGAM1和Ki67蛋白的表達與腦膠質瘤患者的臨床病理特征進行相關性分析，結果表明PGAM1和Ki67蛋白表達與腫瘤病理分級具有相關性，與患者的年齡、性別及腫瘤原發(fā)位置無關。進一步分析顯示，PGAM1高表達的腦膠質瘤標本中Ki67蛋白的表達水平更高。Kaplan-Meier分析顯示，PGAM1和Ki67表達與腦膠質瘤患者的總生存期有關,提示PGAM1和Ki67可能是影響腦膠質瘤患者預后的重要因素，在腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起著協(xié)同作用。

綜上所述，PGAM1和Ki67與腦膠質瘤病理分級密切相關，對腦膠質瘤的診斷、病理分級及預后評價有重要的參考價值。雖然腦膠質瘤在顱腦腫瘤中較為常見，但是其發(fā)病率遠不及其他惡性腫瘤，由于本研究收集病理資料較少，也未對相關機制進行研究，因此，PGAM1對腦膠質瘤診斷的價值，及其與病理分級和Ki67的相關性還需進一步研究。