周紅艷， 孫江偉， 張 薇， 楊 丹， 王 軍△

(1.河南省中醫(yī)藥研究院中藥藥理實驗室， 鄭州 450004；2.河南省省立醫(yī)院藥學(xué)部， 鄭州 450019)

高血壓病是一種常見的心血管疾病，嚴重威脅著人類的生命健康。高血壓與血管重構(gòu)(vascular remodeling, VR)密切相關(guān)。VR是高血壓所致的病理變化及心、腦、腎等靶器官損害的病理基礎(chǔ)[1，2]。高血壓的防治已從傳統(tǒng)的局限于降低血壓轉(zhuǎn)向通過改善血管重構(gòu)從而減輕靶器官損傷及降低并發(fā)癥。降壓寶藍片是河南省中醫(yī)藥研究院高血壓中心系列醫(yī)院制劑之一，臨床療效確切，具有降壓及心、腦、腎靶器官保護作用[3]。陽性藥馬來酸依那普利片為臨床常用降壓藥物，屬于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的一種，用于治療原發(fā)性高血壓。本實驗選用最接近人類原發(fā)性高血壓病理生理過程的自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)為實驗對象，以其遺傳母體京都wistar大鼠(wistar-kyoto，WKY)作對照，通過對胸主動脈病理形態(tài)、中膜厚度、膠原蛋白及彈力纖維的觀察，研究降壓寶藍片對高血壓性VR的影響；通過檢測血清血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)、緩激肽(bradykinin，BK)和一氧化氮(nitric oxide, NO)含量，初步探討降壓寶藍片預(yù)防與逆轉(zhuǎn)高血壓VR的病理生理機制。本研究已通過河南省中醫(yī)藥研究院動物倫理委員會批準，批準號HNTCMDW-20150316-002。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SHR大鼠30只，12周齡，SPF級雄性WKY大鼠10只，12周齡，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號SCXK(京)2015-0001，實驗動物合格證號1150060133361。飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心SPF級動物實驗室，實驗單位使用許可證號SYXK(豫)2019-0001，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(24±1)℃，相對濕度(60±10)%，光照周期12 h/12 h明暗交替，普通飲食，自由飲水。

1.2 藥物

降壓寶藍片，由河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院制劑室提供，批號20150713。在前期的主要藥效學(xué)研究中，共進行了3個劑量(1.2 g·kg-1、0.6 g·kg-1、0.3 g·kg-1)降壓和降脂實驗。本實驗選擇其中1個有效劑量(0.6 g·kg-1)進行靶器官保護作用機制研究[3]。馬來酸依那普利片(江蘇制藥股份有限公司，批號15061002，國藥準字H32026567，每片10 mg)。

1.3 試劑及儀器

HE染色試劑盒(批號325E038)，北京索萊寶科技有限公司；Gomori染色試劑盒(批號15102340116)，南京森貝伽生物科技有限公司；大鼠BK ELISA檢測試劑盒(批號E20160301A)，江蘇卡爾文生物科技有限公司；NO試劑盒(批號20160323)，南京建成生物工程研究所；Masson染色試劑盒(批號1508178004)，福州邁新生物技術(shù)有限公司。

Synergy NEO型多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；Asp-303型自動脫水機、EG-1250C型組織包埋機、RM-2135型石蠟切片機、DM4000型光學(xué)顯微鏡、QWin V3圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥

SHR隨機分為模型組、依那普利組(0.02 g·kg-1)、降壓寶藍片組(0.6 g·kg-1)每組各10只，另設(shè)10只WKY大鼠為空白組。灌胃給藥，給藥體積10 ml/kg-1d-1，連續(xù)12周?？瞻捉M和模型組給予等體積0.5% 羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose，CMC)。

2.2 觀察指標

末次灌胃給藥1 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 g·kg-1)，腹主動脈取血，800×g離心15 min分離血清備用；剪取主動脈弓以下約0.5 cm長的胸主動脈，10%甲醛固定、石蠟包埋、切片備用。

2.2.1 主動脈壁病理形態(tài)觀察 (1) 中膜厚度測定。蘇木素-伊紅(HE)染色：切片經(jīng)蘇木素染色5 min，放入酸水及氨水中分色各15 s，酒精伊紅染色2 min，系列酒精脫水，二甲苯透明、封片。光鏡下觀察胸主動脈病理形態(tài)學(xué)變化；取4處血管環(huán)在周向相互垂直位置包含血管壁中膜區(qū)域的HE染色切片，病理圖像分析系統(tǒng)高倍鏡下(×400)測量中膜厚度(media thickness，MT)并計算平均值。

(2) 主動脈中膜膠原蛋白容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)測定。膠原蛋白Masson染色：切片置于復(fù)合Masson染色溶液中5 min，0.2%乙酸溶液洗滌30 s，1%磷鉬酸溶液分化5 min，亮綠液染色5 min，1%冰醋酸溶液浸洗片刻，無水酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；病理圖像分析系統(tǒng)高倍鏡下(×400)測量膠原蛋白染色面積(collagen staining area，CA)和中膜總面積(total area of media，TA)，取平均值并計算主動脈中膜膠原蛋白容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)。

CVF=CA/TA×100%。

(3) 主動脈中膜彈力纖維容積分數(shù)(elastin volume fraction，EVF)測定。彈力纖維Gomori醛品紅染色：切片經(jīng)Lugol碘液及5%硫代硫酸鈉處理各5 min，水洗，70%乙醇稍浸洗2下，醛品紅液染色10 min，70%乙醇浸洗2次，每次約30 s立即水洗，桔黃G復(fù)染1 s，水洗，95%乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；病理圖像分析系統(tǒng)高倍鏡下(×400)測量中膜選定區(qū)域內(nèi)的彈力纖維面積(elastic fiber area，EA)和(TA)，取平均值并計算主動脈中膜彈力纖維容積分數(shù)(elastin volume fraction，EVF)：EVF=EA/TA×100%。

2.2.2 血清AngⅡ和BK含量測定 取血清按ELISA試劑盒說明書操作，用酶標儀于450 nm波長處分別測定AngⅡ和BK樣品吸光度(A)，根據(jù)標準曲線方程計算各樣品含量。

2.2.3 血清NO含量測定 取血清100 μl，按微板法試劑盒說明書操作，用酶標儀于550 nm處測NO樣品吸光度(A)，計算NO含量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 降壓寶藍片對SHR胸主動脈MT、CVF和EVF的影響

表1～3示，空白組大鼠胸主動脈血管壁內(nèi)三層分界明顯，無明顯增厚，中膜平滑肌細胞核藍染，彈力膜分層清晰，無排列紊亂現(xiàn)象，可見少量膠原蛋白染色。與空白組比較，模型組大鼠中膜單位面積細胞核數(shù)量明顯增多，MT明顯增厚 (P<0.01)，部分出現(xiàn)內(nèi)膜損傷及外膜炎性細胞浸潤現(xiàn)象；Masson染色可見大量深染的膠原蛋白沉積，CVF顯著升高(P<0.01)；Gomori醛品紅染色可見，VSMC及彈力膜排列紊亂，EVF明顯降低(P<0.01)。降壓寶藍片組和依那普利組SHR主動脈組織病理形態(tài)學(xué)明顯改善；與SHR對照組比較，MT、CVF明顯降低(P<0.01)，EVF顯著升高(P<0.01)。

表1 降壓寶藍片對SHR胸主動脈MT、CVF和EVF影響比較

注：A. 空白組；B. 模型組；C. 依那普利組；D. 降壓寶藍片組圖1 胸主動脈組織形態(tài)學(xué)改變比較(HE染色×400)

注：A. 空白組；B. 模型組；C. 依那普利組；D. 降壓寶藍片組圖2 胸主動脈中膜膠原蛋白改變比較(Masson染色×400)

注：A. 空白組；B. 模型組；C. 依那普利組；D. 降壓寶藍片組圖3 胸主動脈中膜彈力纖維改變比較(Gomori醛品紅染色×400)

3.2 降壓寶藍片對SHR血清AngⅡ、BK及NO含量的影響

表2示，與空白組比較，模型組大鼠血清BK含量顯著降低(P<0.05)，NO含量具有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，AngⅡ含量無明顯變化。降壓寶藍片及依那普利均能顯著升高SHR血清BK及NO含量(P<0.05～0.01)；對AngⅡ有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 降壓寶藍片對SHR血清AngⅡ、BK和NO的影響

4 討論

高血壓導(dǎo)致的VR以血管張力改變?yōu)樘卣鳎L期血壓升高致使血管壁壓力負荷，順應(yīng)性降低，血管壁中層增厚，膠原纖維增生，血管管腔狹窄，血流阻力增高，引起重構(gòu)并加重靶器官損傷及并發(fā)癥的出現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，24周齡SHR對照組出現(xiàn)胸主動脈中膜增厚，平滑肌細胞核增多，內(nèi)膜內(nèi)皮細胞損傷及外膜炎性細胞浸潤等病理變化，可見大量深染的膠原蛋白沉積，平滑肌細胞及彈力膜排列紊亂，CVF顯著升高，EVF明顯降低，符合高血壓血管重構(gòu)改變。與文獻報道結(jié)果一致[4，5]。降壓寶藍片能明顯減輕主動脈病理性改變和中膜膠原蛋白沉積，改善主動脈中膜彈力纖維病理形態(tài)，顯著降低SHR胸主動脈MT和CVF，明顯升高EVF，說明降壓寶藍片具有改善高血壓血管重構(gòu)的作用。

以往研究結(jié)果顯示，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)可影響血管重構(gòu)[6]，RAS由腎素、血管緊張素(an-giotension, Ang)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensincon-vertingenzyme, ACE)組成，腎素作用于Ang并使Ang酶解AngⅠ，AngⅠ在ACE的作用下形成AngⅡ，AngⅡ具有很高的生物活性，能促進大量細胞因子及活性物質(zhì)分泌，如血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、金屬蛋白酶等，引起胞外基質(zhì)的沉積及轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致中膜平滑肌細胞增殖并遷移至內(nèi)膜下增生，從而引起內(nèi)皮細胞功能失調(diào)和血管炎性改變及血管重構(gòu)的發(fā)生[7-9]；AngⅡ還可使內(nèi)皮細胞合成的NO迅速滅活，打破NO維持的血管正常構(gòu)型，從而削弱其抑制血管重構(gòu)的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，降壓寶藍片含藥血清可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖和遷移[10]。本研究結(jié)果顯示，各組大鼠血清AngⅡ含量無顯著差異，降壓寶藍片對血清AngⅡ含量較模型組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。有研究提示，高血壓及其靶器官損害與局部AngⅡ含量呈明顯正相關(guān)，與循環(huán)AngⅡ含量無顯著相關(guān)[11]。由于本次實驗未測定SHR胸主動脈中AngⅡ含量，降壓寶藍片改善血管重構(gòu)的作用是否與降低胸主動脈中AngⅡ含量有關(guān)，有待進一步驗證。激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein kinin system，KKS)是體內(nèi)重要的心血管保護因子，對RAS起重要的平衡作用，如調(diào)節(jié)血壓、抑制心肌肥厚的形成、減少缺血再灌注損傷等[12，13]。BK是KKS中的一種重要的活性物質(zhì)，BK作用于血管內(nèi)皮細胞膜緩激肽受體，使其釋放組織纖溶酶原激活物、NO和前列腺素I2等，彌散至血管平滑肌細胞，通過一系列機制引起血管舒張效應(yīng)[14]。此外，BK亦可通過舒張腎入球小動脈，增加腎小球濾過率而起降壓作用[15]。本研究結(jié)果顯示，SHR對照組血清BK含量顯著降低，降壓寶藍片能明顯升高血清中BK含量，促進內(nèi)皮細胞釋放NO，通過擴張小動脈增加組織血流量，抑制平滑肌細胞增殖，發(fā)揮舒張血管效應(yīng)，改善血管重構(gòu)。

降壓寶藍片前期動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，降壓寶藍片對SHR左室肥厚病理形態(tài)學(xué)有明顯改變，具有逆轉(zhuǎn)高血壓左室肥厚及左室重構(gòu)的作用；對SHR收縮壓、舒張壓和平均動脈壓有不同程度的降低作用，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且降壓程度明顯低于陽性對照藥依那普利[3]。本次實驗每周進行一次無創(chuàng)尾動脈血壓測定，發(fā)現(xiàn)降壓寶藍片對SHR血壓的影響與前期研究結(jié)果一致，本文未做詳析。

隨著高血壓患病人數(shù)的增多，中醫(yī)藥在防治高血壓及其靶器官損害方面發(fā)揮著越來越重要的作用。本研究結(jié)果顯示，降壓寶藍片能顯著降低SHR胸主動脈MT和CVF，明顯升高血清BK、NO含量及主動脈EVF。提示降壓寶藍片具有非降壓依賴性改善高血壓血管重構(gòu)的作用，部分作用機制可能與調(diào)節(jié)RAS/KKS平衡有關(guān)。