余 萍，姚 斌，羅紅梅，李樹紅，張紹松*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,云南 昆明 650205；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,北京 100081)

【研究意義】農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的生物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等組成[1]。將農(nóng)林廢棄物中木質(zhì)纖維素作為原材料的生物質(zhì)資源化利用越來越受到關(guān)注[2]。中國農(nóng)作物秸稈種類多、總量大，是世界第一大秸稈產(chǎn)出國[3]。農(nóng)作物秸稈中主要構(gòu)成成分是纖維素、半纖維素等。目前，國內(nèi)外對農(nóng)作物秸稈生物質(zhì)的資源化利用途徑主要包括：作為能源的熱裂解技術(shù)[1]和水熱液化技術(shù)[4]；肥料化技術(shù)和飼料化技術(shù)。其中，肥料化技術(shù)是農(nóng)作物秸稈生物質(zhì)資源化利用的核心[5]。纖維素、半纖維素是農(nóng)作物秸稈廢棄物生物質(zhì)的主要成分，將其發(fā)酵腐解、肥料化利用，需構(gòu)建高效分解生物質(zhì)纖維素的微生物株系及其發(fā)酵工藝，因而，發(fā)掘高效降解的微生物株系是肥料化利用核心的關(guān)鍵。纖維素是構(gòu)成植物體重要成分之一，農(nóng)林牧生產(chǎn)過程中的林木、草和農(nóng)作物的秸稈中含有大量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等。中國可開發(fā)的生物質(zhì)資源總量約為7億t左右標準煤，其中農(nóng)作物秸稈約占50%以上[6]。木質(zhì)纖維素是地球上可再生有機質(zhì)和廉價的重要能源[7]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中每年產(chǎn)生大量的作物秸稈，2006年中國生產(chǎn)的糧食作物秸稈約4.89億t，且總體上呈現(xiàn)逐年增加的趨勢[8]。這些秸稈中含有豐富的纖維素資源，約占生物質(zhì)資源總量的38.9%[9]，然而大部分卻沒有充分的利用，直接以焚燒、廢棄的方式進行處理，這不僅給環(huán)境造成了嚴重的污染，也是一種資源浪費。傳統(tǒng)的降解木質(zhì)纖維素方法易產(chǎn)生有害化學(xué)物，故常用酶法或與酶結(jié)合的方法進行降解[10]。利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶來催化降解秸稈是最經(jīng)濟環(huán)保的生物降解方法。微生物降解過程中無二次污染，加快秸稈的腐熟進程，腐熟秸稈可作為肥料施用，不僅排除了因施用化學(xué)肥料引發(fā)的環(huán)境污染，也可間接增加農(nóng)民收入?！厩叭搜芯窟M展】降解纖維素的微生物，目前報道較多的是真菌，常具有較高的胞外纖維素酶活性，如木霉屬(Trichoderma)[11]、曲霉屬(Aspergillus)[12]和青霉屬(Penicillium)[13-15]等。據(jù)統(tǒng)計，國際纖維素酶市場上有20%的纖維素酶來自木霉屬和曲霉屬[16]。近年來，有關(guān)細菌產(chǎn)生纖維素酶方面的報道也較多，如高效降解纖維素的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[17-19]、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)與貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)[20]、短小芽孢桿菌(B.pumilus)[21]以及纖維單胞菌(Cellulomonassp.)[22]等細菌?？梢?，有關(guān)微生物降解木質(zhì)纖維素方面的研究是該領(lǐng)域的研究熱點之一。農(nóng)作物秸稈中除了含有纖維素主要成分外，同時含有其它的化學(xué)成分。通過多種微生物菌系組合，產(chǎn)生多種酶系，可提高微生物對秸稈的降解效果[23-24]。然而，發(fā)掘具有高效降解能力的單一菌株是基礎(chǔ)，通過高效降解菌株之間的組合，才能研發(fā)更高效的降解組合?！颈狙芯壳腥朦c】孟侖石灰山國家級自然保護區(qū)位于云南省西雙版納傣族自治州，森林資源豐富，長期積累覆蓋大量枯枝落葉，在自然環(huán)境中受微生物作用被分解，這種環(huán)境有利于纖維素分解菌的自然富集，更易獲得具有纖維素酶高活力的微生物。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究從海拔584 m的孟侖石灰山(21°54′8.1″N，101°16′59.3″E)附近的原始森林腐殖土壤中分離微生物，并篩選高效分解纖維素的菌株，旨在挖掘產(chǎn)生纖維素酶的微生物資源，為農(nóng)作物秸稈等廢棄生物質(zhì)纖維素的降解提供潛在生產(chǎn)菌，對廢棄物的資源化利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品的采集 選擇西雙版納孟侖石灰山國家級自然保護區(qū)內(nèi)腐木及枯枝落葉腐爛程度高的地區(qū)為采集地點，采集5 cm以下的表層土壤樣品，采集的樣品處置方法同文獻[25]，放入自封袋中。然后放入低溫冰盒運回實驗室，置于4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g，NH4NO31.0 g，酵母粉 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，瓊脂15.0 g，加H2O溶解，定容至1 L。

LB培養(yǎng)基：制備LB培養(yǎng)基的各組分比例與方法同文獻[25],固體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。

1.1.3 主要儀器和試劑 PCR 擴增儀、恒溫培養(yǎng)箱DHP-600、恒溫振蕩器TL-C、超凈工作臺SW-CJ-1F、紫外凝膠成像系統(tǒng)Genegenius、顯微鏡SZH10、分光光度計DU730等儀器的生產(chǎn)產(chǎn)家參見文獻[25]；合成引物的公司同文獻[25](細菌16S rDNA的通用引物27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3’)；提取細菌基因組DNA的試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖等試劑；以及酵母膏、蛋白胨、NaCl等試劑的來源與文獻[25]中同種試劑的來源相同。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化 本試驗采用稀釋平板法分離和純化：在超凈工作臺上稱取10 g土樣，加入盛有100 mL無菌水、并裝有玻璃珠的三角瓶中，置于30 ℃搖床150 r/min震蕩30 min，吸取1 mL菌懸液，用無菌水進行濃度梯度稀釋，從稀釋倍數(shù)為10-3、10-4、10-5、10-6的菌懸液中分別吸取200 μL，依次涂布在平皿中LB固體培養(yǎng)基上，方法同文獻[25]，然后將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中，30 ℃培養(yǎng)3 d。挑選出在培養(yǎng)基上生長良好的單菌落，進一步在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)與純化。

1.2.2 分解纖維素菌株的篩選 采用剛果紅染色法篩選具有分解纖維素活性的菌株。將上述分離純化的菌株接種至CMC-Na固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，用0.1%的剛果紅水溶液浸染30 min，棄染液，再用1 mol/L的NaCl水溶液脫色1 h，棄脫色液，用游標卡尺測量菌落直徑(用d表示，單位cm)和水解圈直徑(用D表示，單位：cm)，以Dp表示水解能力：Dp=D/d。

1.2.3 菌株的細胞形態(tài)及生理生化特性鑒定 挑取每個具有水解圈菌株的單菌落，在載玻片上涂片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的細胞形態(tài)，并按照《伯杰細菌鑒定手冊》[26]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[27]，進行生理生化反應(yīng)方面的鑒定。

1.2.4 具有分解纖維素活性菌株的16S rDNA分子鑒定 采用細菌基因組DNA提取試劑盒，分別對具有分解纖維素活性的菌株進行基因組DNA的提取，并對提取的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠(1%)電泳檢測和凝膠成像系統(tǒng)檢測，拍照。采用細菌16S rDNA 的2個通用引物，以提取的各菌株基因組DNA樣品分別作為模板，進行PCR擴增反應(yīng)與檢測。PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件、電泳檢測和膠回收等方法參見文獻[25]。反應(yīng)體系為 50 μL，其中2 μL模板DNA，1 μLTaqDNA聚合酶，4 μL dNTP，1 μL引物27f，1 μL引物1492r，5 μL的10×Buffer，36 μL ddH2O。擴增反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性50 s，59 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min；38個循環(huán)，72 ℃最終延伸10 min，4 ℃保存。經(jīng)檢測和拍照后，膠回收的DNA片段送至上海立菲生物技術(shù)公司進行測序。

經(jīng)測序獲得的16S rDNA序列，進一步與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的16S rDNA核酸序列進行BLAST同源性分析，方法與文獻[25]相同。在比對結(jié)果中，尋找16S rDNA基因序列高度同源的近緣種，采用MEGA 5.0軟件，進行多重序列比對分析，通過Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用 Bootstrap對進化樹進行 1000 次可信度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌的分離與篩選

對西雙版納原始森林5個不同地方采集的樣品經(jīng)LB培養(yǎng)基分離純化后共獲得34株細菌，依次編號為BN-1～BN-34。將這些菌株轉(zhuǎn)接到纖維素篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，經(jīng)剛果紅染色與脫色后，共有5株細菌產(chǎn)生較為清晰的透明圈(圖1)，分別為：BN-6、BN-9、 BN-17、 BN-22和BN-33菌株。從圖1和表1可以看出，BN-22菌株的纖維素分解能力最強，其次為BN-9菌株，BN-33菌株的降解纖維素能力最弱。采用游標卡尺進一步測量各菌株的透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)，并計算兩者比值，結(jié)果見表 1?？梢?BN-22菌株的D/d值最大。

2.2 具有分解纖維素活性菌株的形態(tài)特征及生理生化特性

光學(xué)顯微鏡下觀察5個菌株在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖2所示。BN-6菌株的菌落中央部位凹陷，表面粗糙，邊緣不規(guī)則。BN-9菌株的菌落中央凸起，邊緣光滑整齊。BN-17菌株的菌落邊緣不規(guī)則。BN-22菌株的菌落表明光滑，有不規(guī)則凸起形狀，邊緣光滑整齊。BN-33菌株的菌落中央部位凹陷，表面粗糙，邊緣不規(guī)則。將具有分解纖維素活性的5個株菌進行革蘭氏染色觀察，5個菌株均呈陽性，并且均產(chǎn)芽孢(圖3),表明具有分解纖維素活性的5株細菌分離物均為芽孢桿菌屬(Bacillus)的種。5個菌株的甲基紅、V-P實驗和苯丙氨酸脫氨酶均為陰性，接觸酶、明膠液化實驗和精氨酸雙水解均為陽性。BN-33菌株的脲酶為陽性外,其余4個菌株均為陰性。BN-9和BN-17菌株的葡萄糖發(fā)酵為陰性，BN-6、BN-22和BN-33菌株為陽性。5個株菌的各項生理生化特征見表2。

表1 纖維素降解菌株的水解圈與菌落直徑比值

2.3 具有分解纖維素活性菌株的16S rDNA鑒定

分別以5個菌株的基因組DNA為模板，采用16S rDNA的通用引物進行PCR 擴增反應(yīng)，獲得長度約為1500 bp的片段(圖4)，進一步回收5個菌株的PCR擴增片段DNA,測定每個菌株約1500 bp擴增片段的DNA序列，并將獲得的5個菌株的16S rDNA基因序列分別在NCBI 數(shù)據(jù)庫中BLAST 比對，發(fā)現(xiàn)菌株BN-6菌株、BN-9菌株、BN-17菌株和BN-33菌株與數(shù)據(jù)庫中的多種芽孢桿菌屬(Bacillus)的序列相似性均為99%，BN-22菌株與沙福芽孢桿菌(B.safensis)和短小芽胞桿菌(B.pumilus)序列相似性均為100%。每個菌株與對應(yīng)親緣關(guān)系較近的3株細菌的16S rDNA基因序列，與文獻[25]

中方法相同，采用MEGA 5.0軟件進行多重序列比對分析，用Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。結(jié)果顯示，5個菌株可分在2個不同的進化分支上，BN-6、BN-9、BN-17和BN-33菌株為一個分支，BN-22菌株另為一個分支。結(jié)合生理生化VP實驗陰性結(jié)果，說明BN-22菌株為沙福芽孢桿菌。BN-6、BN-9、BN-17和BN-33菌株不屬于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)。BN-9菌株的菌落為黃色，結(jié)合其它試驗結(jié)果和16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，該菌株為吉氏芽孢桿菌(B.gibsonii)。根據(jù)培養(yǎng)特征、生理生化特征及16S rDNA序列的分析結(jié)果，推測BN-6、BN-17和BN-33菌株為嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)等幾種菌中的屬種，有關(guān)這幾株細菌在分類上的屬種尚需進一步研究和鑒定。

表2 具有分解纖維素活性菌株的生理生化特征

3 討 論

不同類型的生態(tài)環(huán)境中分布有相應(yīng)的微生物類群，如：邱秀文等[14]從秸稈還田環(huán)境中分離篩選到纖維素分解菌；張喜慶等[19]從自然發(fā)酵的牛糞分離獲得高效分解纖維素的分解菌；Varghes等[28]從白蟻腸道和蟻穴分離到分解纖維素的格蘭氏陽性菌株等。本研究在云南省西雙版納州的孟納石灰山原始森林區(qū)域，分離獲得的具有分解纖維素活性的菌株，與已報道的同屬種菌株的功能存在差異。如：張知曉等[29]報道的沙福芽孢桿菌(B.safensis),所關(guān)注的是抑菌特性，尚未報道菌株的分解纖維素活性；本研究中分離獲得具有分解纖維素高活性的吉氏芽孢桿菌(B.gibsonii),陳錚等[30]報道了該菌的發(fā)酵液中含有來氟米特，未報道其所分離菌株對纖維素的分解特性。本研究分離獲得的5株細菌，其中2株已鑒定其屬種，3株細菌初步鑒定其為芽孢桿菌類群，但明確的屬種分類尚待進一步研究，便于發(fā)掘利用其功能。

同時，通過篩選、分離獲得的微生物菌株，需進一步明確微生物產(chǎn)生的分解酶類別。本研究中采用的CMC-Na纖維素作為底物，篩選和檢測所分離菌株的纖維素酶活性，是纖維素酶活檢測的常用方法。通過分離與篩選獲得的5株芽孢桿菌，需進一步對其產(chǎn)生的纖維素酶類別和濾紙酶活性進行定性與定量的檢測，以便發(fā)掘和利用菌株的生物學(xué)功能，更好地應(yīng)用于生產(chǎn)。

生態(tài)環(huán)境不同，其分布的微生物類群亦存在差異。在腐解生物質(zhì)的角度，不同林木、草、或秸稈的生物質(zhì)類別，雖都含有纖維素，但因不同材質(zhì)與來源的成分、種類及含量的差別，以及腐解菌株組成與反應(yīng)環(huán)境條件的差異，對纖維素分解的效果也會千差萬別。因而，需對菌株的最適反應(yīng)條件、分解效果最好的秸稈類型、分解菌株的最佳組合等條件進行探索，可望獲得最佳的腐解秸稈木質(zhì)纖維素的工藝條件。同時，原始生林土壤中也會富集了多樣性的微生物區(qū)系，有待于進一步地挖掘。

4 結(jié) 論

原始森林長期累積枯枝落葉于林地土壤，富集有豐富的微生物類群。由于枝落葉中含有大量的木質(zhì)纖維素，林地土壤可有效富集纖維素分解細菌.通過分離純化，經(jīng)鑒定獲得兩株細菌對纖維素具有良好的分解效果，有待進一步發(fā)掘利用。