徐從英，王 萌，梁曉宇，馬 騰，楊 葉，張 宇*

(1.海南大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?570228； 3.天然橡膠省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，海南 ?？?570228)

【研究意義】橡膠樹(Heveabrasiliensis)因相較于其他產(chǎn)膠植物具有不可媲美的優(yōu)越性，在亞非拉國(guó)家適宜地區(qū)廣泛種植。我國(guó)橡膠樹的種植主要分布在云南、海南、廣東、廣西等熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]。其中云南因其光照充足、少寒害低溫、晝夜溫差大、無臺(tái)風(fēng)襲擊等獨(dú)特自然地理?xiàng)l件，已成為我國(guó)最好的天然橡膠基地[2]。2011年底，云南省橡膠種植面積首超海南省成為我國(guó)橡膠種植面積最大的省份，其中主要植膠區(qū)西雙版納的橡膠樹干膠產(chǎn)量占云南省干膠總產(chǎn)量的72.73%[3]。由炭疽菌(Colletotrichumspp.)引起的炭疽病是橡膠樹的重要葉部病害之一。該病菌可侵染橡膠樹的葉、嫩梢和果實(shí)，嚴(yán)重時(shí)引起嫩葉脫落、嫩梢回枯、果實(shí)腐爛[4]。由于氣候變化、病原菌適應(yīng)環(huán)境性增強(qiáng)、橡膠樹抗病性下降等因素，該病發(fā)生日趨頻繁，嚴(yán)重影響膠乳產(chǎn)量[5-6]。而該病原菌的分類鑒定對(duì)橡膠樹炭疽病防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】炭疽菌種類繁多，遺傳多態(tài)性豐富，目前我國(guó)橡膠樹炭疽病主要病原菌為膠孢炭疽菌復(fù)合群 (Colletotrichumgloeosporioidesspecies complex) 和尖孢炭疽菌復(fù)合群(Colletotrichumacutatumspecies complex)。其中膠孢炭疽復(fù)合群包括C.siamense、C.fructicola、C.ledongense等，尖孢炭疽復(fù)合群包括C.bannanense、C.australisinense、C.laticiphilum、C.wanningense等[7-8]。由于復(fù)合群中的不同種的生物學(xué)特性不同，使得橡膠樹膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌復(fù)合群內(nèi)在種群比例、分布范圍、為害癥狀和為害程度等方面存在明顯差異[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前膠孢炭疽復(fù)合群下的C.siamense以及尖孢炭疽復(fù)合群下的C.wanningense為海南地區(qū)橡膠樹炭疽菌的優(yōu)勢(shì)種[10]，云南地區(qū)橡膠樹炭疽菌復(fù)合群的種屬分類及優(yōu)勢(shì)種尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對(duì)云南西雙版納地區(qū)橡膠樹炭疽病菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析和室內(nèi)藥劑篩選，明確云南主要植膠區(qū)的橡膠樹炭疽菌復(fù)合群的種屬分類及優(yōu)勢(shì)種，為橡膠樹炭疽病病原檢測(cè)和制定有效防治策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藥劑、培養(yǎng)基、菌株：98%咪鮮胺(Prochloraz)、96%苯醚甲環(huán)唑(Difenoconazole)、98%嘧菌酯(Azoxystrobin)、97.5%吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)原藥購自海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司，吡噻菌胺(Penthiopyrad)分析標(biāo)準(zhǔn)品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1000 mL。本實(shí)驗(yàn)室提供的HN16菌株為在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的橡膠樹炭疽病菌C.cliviae菌株[11]。

供試試劑及儀器：DNA 提取試劑盒購自O(shè)mega公司，高保真PCR 擴(kuò)增試劑盒及DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。BDS400倒置生物顯微鏡購自重慶奧體光學(xué)儀器有限公司，T100-PC PCR擴(kuò)增儀購自美國(guó)伯樂公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的采集和分離 橡膠樹炭疽病病葉于2019年2月22—23日期間采集于云南省西雙版納地區(qū)景洪市東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)(21.72°N,100.78°E)和勐臘縣勐捧農(nóng)場(chǎng)(21.41°N,101.38°E)。每個(gè)采集地選取20個(gè)發(fā)病植株，每株采集一個(gè)具有典型發(fā)病癥狀的葉片。在病健交界處切取5.0 mm ×5.0 mm大小的葉片，用75%酒精浸泡40～60 s，再用0.1%的升汞浸泡1～2 min后用無菌水漂洗3次，放在滅菌濾紙上晾干后置于PDA平板上。于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，選取菌落邊緣的菌絲繼續(xù)純化培養(yǎng)。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的菌株接種在PDA平板上，28 ℃條件下培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)并測(cè)量直徑，在顯微鏡下觀察10個(gè)以上視野的分生孢子形態(tài)特征，每個(gè)視野觀察20個(gè)孢子，根據(jù)炭疽菌分生孢子形態(tài)特征初步鑒定后[12]，單孢分離所得的菌株編號(hào)并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病原菌致病性測(cè)定 挑選健康的橡膠樹變色期葉片用75%酒精表面消毒處理1 min，再用無菌水清洗3次，晾干備用。選取已產(chǎn)生橘色孢子堆的炭疽菌PDA平板，用無菌水洗下分生孢子，制成濃度為106個(gè)/mL的孢子懸浮液。取10 mL孢子懸浮液對(duì)葉片正面進(jìn)行噴施接種。對(duì)照采用無菌水處理，設(shè)5個(gè)重復(fù)。將接種的橡膠樹葉放置在帶有濕潤(rùn)無菌濾紙的塑料盒中，在28 ℃、100%相對(duì)濕度的人工氣候箱中培養(yǎng)直至發(fā)病癥狀出現(xiàn)，觀察統(tǒng)計(jì)葉片發(fā)病情況。分離純化發(fā)病葉片中的病原菌，與原接種菌株比較形態(tài)特征。

1.2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 通過DNA提取試劑盒提取橡膠樹炭疽菌的基因組DNA。靶標(biāo)基因?yàn)楹颂求w轉(zhuǎn)錄間隔(ITS)、肌動(dòng)蛋白基因(ACT)、微管蛋白基因(TUB)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)、幾丁質(zhì)合成酶基因(CHS-1)，引物序列與反應(yīng)體系同文獻(xiàn)[13]。擴(kuò)增產(chǎn)物送廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司測(cè)序。測(cè)序所得序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知基因序列進(jìn)行BLAST同源性檢索，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與待測(cè)菌株相似度95%以上的部分炭疽菌菌株序列，采用鄰接法運(yùn)用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 5種殺菌劑對(duì)橡膠樹C.cliviae菌株的室內(nèi)毒力測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定供試橡膠樹C.cliviae菌株對(duì)咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、吡噻菌胺的敏感性[12]。根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同藥劑系列濃度：0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/L(咪鮮胺)；0.1、0.5、1、2、5 mg/L(苯醚甲環(huán)唑)；0.1、0.5、1、5、10 mg/L(嘧菌酯 + 50 mg/L 水楊羥肟酸)；0.1、0.5、1、5、10 mg/L(吡唑醚菌酯 + 50 mg/L 水楊羥肟酸)；0.1、0.5、1、2、5 mg/L(吡噻菌胺)。在培養(yǎng)4 d的炭疽菌PDA平板打取菌碟，接種到含藥平板，以含有等體積溶劑的平板為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3～5皿，試驗(yàn)重復(fù)2次， 28 ℃培養(yǎng)4 d后測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。利用DPS軟件建立藥劑濃度對(duì)數(shù)(x)與菌絲生長(zhǎng)抑制機(jī)率值(y)之間的毒力回歸方程y= ax+ b，計(jì)算有效抑制中濃度(EC50)及相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離及形態(tài)學(xué)鑒定

從云南西雙版納地區(qū)景洪市和勐臘縣橡膠林采集的橡膠樹炭疽病病葉各20份。經(jīng)分離純化獲得菌絲形態(tài)特征疑似炭疽菌的菌株共37株，其中景洪市19株，編號(hào)為JH1至JH19，勐臘縣18株，編號(hào)為M1至M18。37株菌株的菌落具有一致的形態(tài)特征，菌落棉絮狀，菌絲初期呈白色，培養(yǎng)第5天時(shí)，菌落中間出現(xiàn)橘色孢子堆，產(chǎn)生分生孢子。由于JH3和JH5菌株未產(chǎn)孢，對(duì)其余35個(gè)菌株進(jìn)行了分生孢子形態(tài)鑒定，分生孢子單胞，無色，內(nèi)含1個(gè)或2個(gè)或多個(gè)油球，大小為(9.8～17.5)μm ×(2.9～4.8)μm，初步鑒定這35個(gè)菌株均屬于炭疽菌Colletotrichum(圖1)。其中23個(gè)菌株的分生孢子兩端鈍圓，12個(gè)菌株分生孢子一端尖銳，符合膠孢炭疽菌復(fù)合群和尖孢炭疽菌復(fù)合群的特征，具體種屬有待于進(jìn)一步分子鑒定。

2.2 病原菌的致病性檢測(cè)

將35個(gè)菌株的分生孢子接種健康橡膠樹葉片，36 h后即發(fā)病，接種癥狀與田間發(fā)病癥狀相似。分離純化發(fā)病葉片中的菌株，發(fā)現(xiàn)其與原接種菌株具有相同的形態(tài)特征。根據(jù)柯赫氏法則，判定這35個(gè)菌株為橡膠樹炭疽病的致病菌(圖2)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以上述35個(gè)菌株的基因組DNA為模板，擴(kuò)增ITS、 ACT、TUB、GAPDH和CHS-1基因并測(cè)序。將測(cè)序所得序列經(jīng) NCBI 數(shù)據(jù)庫序列對(duì)比后確定該35株菌株同屬于炭疽菌屬，比對(duì)結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。選取了包括已報(bào)道的橡膠樹炭疽菌菌株在內(nèi)的共31個(gè)菌株基因序列作為參考序列[8]，利用ITS、ACT、TUB、GAPDH、CHS-1五個(gè)基因的拼接序列，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明，35株炭疽菌可分為4個(gè)種，分別為膠孢炭疽菌復(fù)合群下的C.siamense，尖孢炭疽菌復(fù)合群下的C.laticiphilum和C.wanningense，以及新種C.cliviae。這是C.cliviae在云南地區(qū)橡膠樹炭疽病菌中的首次報(bào)道。測(cè)序菌株中有22株屬于孢炭疽菌復(fù)合群，占比63%，且均為C.siamense菌株。有12株屬于尖孢炭疽菌復(fù)合群，占比34%，其中4株為C.laticiphilum菌株，8株為C.wanningense菌株。

2.4 5種殺菌劑對(duì)橡膠樹C.cliviae菌株的室內(nèi)毒力測(cè)定

5種殺菌劑對(duì)橡膠樹C.cliviae菌株的菌絲生長(zhǎng)具有不同程度的抑制效果，EC50為0.075～1.090 mg/L(表1)。5種殺菌劑抑制效果大小依次為咪鮮胺、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑和吡噻菌胺。5種殺菌劑對(duì)海南HN16菌株和云南M3菌株抑制效果相當(dāng)，EC50差值不超過0.08 mg/L。

3 討 論

炭疽病是我國(guó)橡膠樹的重要葉部病害之一，其病原物炭疽菌種類繁多，遺傳多態(tài)性豐富，不同種間形態(tài)和保守基因序列差異小，給分類鑒定工作造成了很大困難。采用形態(tài)學(xué)鑒定和rDNA-ITS序列分析的方法對(duì)炭疽菌的鑒定僅局限于復(fù)合群水平，對(duì)復(fù)合群中種的鑒定能力不足[15-16]。多基因系統(tǒng)進(jìn)化分析技術(shù)很好地解決了炭疽菌分類上的困難。Damm等基于TUB、GAPDH、CHS-1基因序列的進(jìn)化分析方法成功地鑒定出尖孢復(fù)合群中的Colletotrichumlaticiphilum[17]。Hunupolagama等利用ITS、GAPDH、TUB基因序列的進(jìn)化分析方法明確了斯里蘭卡地區(qū)橡膠樹尖孢炭疽菌復(fù)合群中的種類別[18]。Liu等采用ITS、ACT、TUB、GAPDH、CHS-1基因序列的進(jìn)化分析方法對(duì)我國(guó)橡膠樹膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌復(fù)合群下的種進(jìn)行了鑒定和分類[8]。本研究采用形態(tài)學(xué)和多基因系統(tǒng)進(jìn)化分析相結(jié)合的鑒定方法，闡明了我國(guó)云南西雙版納地區(qū)的橡膠樹炭疽病菌的種屬分類與優(yōu)勢(shì)種。

本研究成功鑒定出云南西雙版納地區(qū)35株橡膠樹炭疽病菌，其中63%為膠孢炭疽菌復(fù)合群，34%為尖孢炭疽菌復(fù)合群。Cao等發(fā)現(xiàn)海南地區(qū)橡膠樹炭疽病菌中有78%為膠孢炭疽菌復(fù)合群，22%為尖孢炭疽菌復(fù)合群[7]。由此可見，我國(guó)云南和海南地區(qū)的橡膠樹炭疽病菌種群比例差異不大，優(yōu)勢(shì)種群均為膠孢炭疽菌復(fù)合群。此外，在云南西雙版納地區(qū)發(fā)現(xiàn)的膠孢炭疽菌復(fù)合群中的菌株均屬于C.siamense，說明該病原菌是云南西雙版納地區(qū)橡膠樹炭疽病菌的優(yōu)勢(shì)種，與此前報(bào)道的C.siamense為我國(guó)橡膠樹膠孢炭疽菌復(fù)合群中的優(yōu)勢(shì)種相一致[8]。Shi等在我國(guó)云南地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)了橡膠樹炭疽病菌C.laticiphilum菌株[19]，本次鑒定的尖孢炭疽菌復(fù)合群中有4個(gè)菌株也屬于C.laticiphilum。已有研究表明，C.laticiphilum是我國(guó)橡膠樹尖孢炭疽復(fù)合群的主要種之一[8-9]。此前有報(bào)道在云南紅河和德宏地區(qū)發(fā)現(xiàn)橡膠樹炭疽病菌C.boninense[20]，在德宏地區(qū)發(fā)現(xiàn)橡膠樹炭疽病菌發(fā)現(xiàn)C.karstii[21]，本研究未在西雙版納地區(qū)未發(fā)現(xiàn)這兩種炭疽菌，可見其引起的炭疽病尚處于零星發(fā)生狀態(tài)。另外，Cao等在我國(guó)海南地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)了橡膠樹尖孢炭疽菌復(fù)合群下的C.wanningense菌株[10]，本研究在云南地區(qū)橡膠樹上同樣發(fā)了8個(gè)C.wanningense菌株。由此可見，我國(guó)橡膠樹炭疽菌種類地域性差異不大，但與斯里蘭卡的橡膠樹炭疽菌種類明顯不同[18]，這可能與氣候和種植品種不同有關(guān)，其地域分布差異性有待于進(jìn)一步研究。近期本實(shí)驗(yàn)室在海南地區(qū)發(fā)現(xiàn)的HN16菌株是首次在我國(guó)報(bào)道的橡膠樹C.cliviae[11]。本研究也成功分離出1個(gè)C.cliviae菌株M3，此為云南地區(qū)橡膠樹C.cliviae的首次發(fā)現(xiàn)，這說明C.cliviae可能已在我國(guó)植膠區(qū)分布廣泛。為了預(yù)防新種C.cliviae可能引起的橡膠樹炭疽病危害，本研究測(cè)定了5種殺菌劑對(duì)橡膠樹C.cliviae菌株M3和HN16的室內(nèi)毒力。結(jié)果表明，麥角甾醇合成抑制劑類、甲氧基丙烯酸酯類、琥珀酸脫氫酶抑制劑類這三種殺菌劑對(duì)C.cliviae均有良好的菌絲生長(zhǎng)抑制作用，EC50值不大于1.09 mg/L，其中咪鮮胺抑制效果最佳，EC50值為0.075～0.084 mg/L。咪鮮胺是我國(guó)防治橡膠樹炭疽病的重要藥劑之一。2017年的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，咪鮮胺對(duì)35株橡膠樹膠孢炭疽菌和20株橡膠樹尖孢炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)抑制EC50值均小于0.08 mg/L[7]。綜上所述，咪鮮胺對(duì)我國(guó)橡膠樹炭疽病菌的抑制活性依然良好，尚可繼續(xù)用于橡膠樹炭疽病的防治。

表1 5種殺菌劑對(duì)橡膠樹C.cliviae菌株的毒力作用

4 結(jié) 論

本研究成功分離鑒定出云南西雙版納地區(qū)橡膠樹炭疽病菌35株，其中63%的菌株屬于膠孢炭疽菌復(fù)合群，34%的菌株屬于尖孢炭疽菌復(fù)合群，優(yōu)勢(shì)種為膠孢炭疽菌復(fù)合群下的C.siamense。另外，咪鮮胺對(duì)我國(guó)新發(fā)現(xiàn)的橡膠樹C.cliviae的抑制效果依然良好。