單 羽,任曉寧,姚禹希,李 鑫,李雪梅
(沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110034)
【研究意義】稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)引起的水稻真菌性病害,是最具毀滅性的水稻病害之一,該病可在短時(shí)間大面積爆發(fā),使其嚴(yán)重減產(chǎn),甚至絕收[1]。全球每年由稻瘟病引起的水稻產(chǎn)量損失約為總量的10%~30%,它可以養(yǎng)活至少6000萬(wàn)人,經(jīng)濟(jì)價(jià)值高達(dá)660億美元[2]。因此對(duì)于稻瘟病的防治也是重中之重,通過(guò)堿蓬內(nèi)生菌EF0801侵染水稻,研究?jī)?nèi)生菌侵染是否能夠誘導(dǎo)水稻增強(qiáng)對(duì)稻瘟病菌的抵抗能力具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻在受到稻瘟病菌感染時(shí),其葉綠素含量逐漸降低[3]。葉綠素?zé)晒庾鳛橐环N非侵入性且非破壞性的方法,可以更好地了解病原體感染過(guò)程中光合作用的變化。在宿主-病原體互作過(guò)程中,小麥[4-5]、水稻[6]、玉米[7]、大豆[8]的葉綠素?zé)晒鈪?shù)會(huì)發(fā)生變化。通常,病原體感染的植物葉片有效PSII量子效率下降,受調(diào)節(jié)能量耗散的量子產(chǎn)量的增加以及最大PSII量子產(chǎn)量的下降[9]。另外,植物在正常狀態(tài)下由于防御酶(如SOD、CAT和POD)等活性氧清除系統(tǒng)的存在而使體內(nèi)活性氧處于動(dòng)態(tài)平衡[10]。當(dāng)植物處于脅迫條件下(如病原體感染)會(huì)使活性氧增加[11-12]。因此,有效的清除活性氧,可以避免由于膜脂過(guò)氧化和破壞大分子對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的氧化損傷。Eberhard等[13]研究發(fā)現(xiàn)在接種稻瘟病后,水稻葉片POD活性快速上升,POD活性與抗瘟性呈正相關(guān),活性增強(qiáng)有利于水稻對(duì)稻瘟病的抗性?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái),內(nèi)生菌的研究成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。植物內(nèi)生菌是指全部階段或部分階段生活在健康的植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙的微生物資源[14]。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明,內(nèi)生真菌會(huì)增加宿主植物對(duì)生物和非生物脅迫的耐受性[15-17]。Shabanamol等[18]從水稻中分離出一株內(nèi)生固氮芽孢桿菌(Lysinibacillussphaericus),可以誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生更多的防御酶,減輕紋枯病的危害。深色有隔內(nèi)生真菌(DSE)可以通過(guò)降低水稻植株中氧化應(yīng)激反應(yīng)和抗氧化酶的活性從而保護(hù)水稻細(xì)胞免受氧化損害,進(jìn)而增強(qiáng)水稻在缺水條件下的耐受性[19]。研究堿蓬內(nèi)生菌(EF0801)與水稻互作關(guān)系及作用機(jī)理具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用5%的堿蓬內(nèi)生菌(EF0801)菌懸液對(duì)未感染及感染稻瘟病菌的水稻進(jìn)行處理。測(cè)定其處理7 d后的形態(tài)指標(biāo)、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)及抗氧化酶活性的變化。探討內(nèi)生菌侵染是否能夠誘導(dǎo)水稻對(duì)稻瘟病菌的抵抗能力,以期為提高水稻稻瘟病抗性提供一種新的方法。
供試水稻(OryzasativaL.)品種為遼星1號(hào)。將精選的水稻種子置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),黑暗下28 ℃浸種24 h后30 ℃催芽24 h。將露白種子均勻地鋪滿盛有完全營(yíng)養(yǎng)液(Hoagland)的燒杯(覆蓋紗網(wǎng))上進(jìn)行水培。在人工氣候培養(yǎng)箱(晝夜溫度28 ℃/26 ℃;光照16 h;80%相對(duì)濕度;光強(qiáng)3000 lx)培養(yǎng),每天適時(shí)適量的補(bǔ)充Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液。待水稻幼苗長(zhǎng)至2葉1心期進(jìn)行處理。
堿蓬內(nèi)生菌EF0801為沈陽(yáng)師范大學(xué)微生物教研室篩選獲得。將EF0801菌株轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中,在恒溫?fù)u床上120 r/min,24 ℃培養(yǎng)10 d。用攪拌機(jī)將菌球打碎,菌懸液備用。
稻瘟病病菌由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。參照李元等[28]的方法,將稻瘟病菌菌絲移至產(chǎn)孢培養(yǎng)基,在26 ℃、10 h/d光照培養(yǎng)8~10 d,將孢子懸浮液濃度調(diào)至約3×105(孢子)/mL作為苗期噴霧接種體。
選取長(zhǎng)勢(shì)相同的2葉1心期水稻幼苗分為4組進(jìn)行處理。對(duì)照組(CK):整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均使用完全營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng);內(nèi)生菌侵染組(E):將5%的堿蓬內(nèi)生菌EF0801菌懸液加入到完全營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng);稻瘟病病菌感染組(RB):將稻瘟病菌孢子液噴灑至水稻幼苗葉片上,直到剛好有水珠為止;稻瘟病和內(nèi)生菌處理組(RB+E):將5%的堿蓬內(nèi)生菌EF0801菌懸液加入到完全營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),在第2 天將稻瘟病菌孢子液噴灑至水稻幼苗葉片上。處理7 d后,測(cè)定水稻的相關(guān)指標(biāo),每個(gè)處理重復(fù)3次。
1.3.1 形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 選取10株幼苗,分別測(cè)定株高、根長(zhǎng)、鮮重和干重。
1.3.2 葉綠素含量、防御酶活性以及丙二醛(MDA)含量的測(cè)定 參照李小方和張志良[22]的方法并加以改良,測(cè)定Chla、Chlb、類胡蘿卜素(Cars)含量、防御酶SOD、POD和CAT活性以及MDA含量。
1.3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 選擇長(zhǎng)勢(shì)相同的幼苗,使用連續(xù)激發(fā)式熒光儀Pocket PEA測(cè)定。測(cè)定時(shí)間為10:00—14:00,測(cè)定前對(duì)葉片進(jìn)行暗處理20 min。在OJIP曲線測(cè)定中,誘導(dǎo)光強(qiáng)度設(shè)為3000 μmol/(m2·s)脈沖紅光,從10 μs開始記錄相對(duì)熒光強(qiáng)度,其中OJIP曲線上0.02、2、30和1000 μs對(duì)應(yīng)的點(diǎn)分別為O、J、I、P,最后利用平均值繪制OJIP曲線,本實(shí)驗(yàn)主要研究不同處理?xiàng)l件下,K點(diǎn)和L點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度以及相關(guān)參數(shù)的變化。
數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0軟件,通過(guò)平均值和方差分析(ANOVA)和LSD檢測(cè),比較其差異顯著性。
株高和根長(zhǎng)可直接反映出植物的生長(zhǎng)情況,同時(shí)生物量也是反映植物生長(zhǎng)的一個(gè)非常有效的指標(biāo)。由圖1可知,經(jīng)過(guò)E處理的水稻幼苗株高、鮮重和干重顯著高于CK組。經(jīng)過(guò)RB處理的水稻幼苗與CK組相比較,根長(zhǎng)及鮮重有顯著性升高,但株高和干重?zé)o變化。而經(jīng)過(guò)RB+E復(fù)合處理與RB處理相比株高和干重顯著升高。
葉綠素是在光合作用中參與吸收、傳遞光能或引起原初光化學(xué)反應(yīng)的色素,其含量直接影響植物的光合能力。經(jīng)過(guò)E處理的水稻幼苗Chla含量顯著增加(圖2-A)。RB處理則顯著降低Chlb含量(圖2-B)。而RB+E處理與RB處理相比,Cars含量顯著升高(圖2-C)。
2.3.1 對(duì)水稻幼苗熒光動(dòng)力曲線OJIP、ΔVOP、ΔVOK以及ΔVOJ的影響 葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線是綠色植物經(jīng)過(guò)暗適應(yīng),突然暴露在強(qiáng)光下以后,植物產(chǎn)生的一條熒光曲線,通常產(chǎn)生O、J、I、P 4個(gè)特征點(diǎn)。熒光誘導(dǎo)(O-J-I-P)呈現(xiàn)典型的多相上升,表明所有葉片樣品都具有光合特性(圖3-A)。對(duì)O-P相的熒光參數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,經(jīng)過(guò)RB處理的水稻幼苗其ΔVOP值大于零,而E和E+RB處理組其ΔVOP值小于零(圖3-B)。同時(shí)對(duì)O點(diǎn)(50 μs)和K點(diǎn)(300 μs)及O點(diǎn)和J點(diǎn)(2 ms)的熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)曲線繪圖,經(jīng)過(guò)RB處理的水稻幼苗ΔVOK、ΔVOJ值均大于零,而經(jīng)過(guò)E和E+RB組處理的水稻幼苗其ΔVOK、ΔVOJ值均小于零(圖3-B,3-C)。ΔVOP>0,說(shuō)明放氧復(fù)合體的活性低;ΔVOK>0,說(shuō)明類囊體之間的能量傳遞受阻,如果ΔVOK≤0,說(shuō)明光合膜系統(tǒng)完整,能量傳遞順暢;ΔVOJ越大,說(shuō)明放氧復(fù)合體受到的傷害越嚴(yán)重。由此說(shuō)明水稻葉片光合膜系統(tǒng)完整、能量傳遞、放氧復(fù)合體活性均優(yōu)于RB組(圖3-B、3-C、3-D),堿蓬內(nèi)生菌EF0801可以有效地減緩稻瘟病菌對(duì)水稻幼苗光PSⅡ的傷害。
2.3.2 對(duì)水稻幼苗性能指數(shù)的影響 與CK相比較,經(jīng)過(guò)RB脅迫后,以單位面積為基礎(chǔ)的性能指數(shù)(PI)有顯著性的下降,而經(jīng)過(guò)E和RB+E處理的有顯著性的提高(圖4-A)。與CK相比較,經(jīng)過(guò)E處理的水稻幼苗葉片以光能吸收為基礎(chǔ)的性能指數(shù)(PIABS)顯著增加,而經(jīng)過(guò)RB處理后則顯著下降,經(jīng)過(guò)E+RB處理后的有一定程度下降,但與RB相比較有顯著性的增加(圖4-B)。
2.3.3 對(duì)水稻幼苗量子效率的影響 不同處理后用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(φEo)、用于熱耗散的量子比率(φDo)和最大光化學(xué)效率(φPo)變化情況。經(jīng)過(guò)E處理的水稻幼苗與CK組相比,φEo顯著提高(圖5-A),而經(jīng)過(guò)RB處理的水稻幼苗φEo和φPo顯著降低(圖5-A、5-C),且其φDo與CK組相比顯著提高;經(jīng)過(guò)RB+E處理的水稻幼苗與RB組相比,其φEo和φPo顯著提高,且φDo顯著降低(圖5-B)。表明內(nèi)生菌侵染能夠提高稻瘟病菌感染后用于電子傳遞的量子產(chǎn)額和最大光化學(xué)效率,降低用于熱耗散的量子比率,提高光合效率。
2.3.4 對(duì)水稻幼苗比活性參數(shù)的影響 PSⅡ比活性參數(shù)包括單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)、單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量(TRo/RC)以及單位反應(yīng)中心耗散掉的能量(DIo/RC)。由圖6顯示,經(jīng)過(guò)E處理的水稻幼苗與CK組相比ABS/RC和TRo/RC無(wú)顯著變化,DIo/RC顯著降低,而經(jīng)過(guò)RB處理的水稻幼苗3種比活性參數(shù)均顯著增加,但經(jīng)過(guò)RB+E處理的水稻幼苗顯著降低。
如圖7所示,經(jīng)過(guò)E處理的水稻幼苗中SOD、POD、CAT活性均顯著升高,而經(jīng)過(guò)RB處理均無(wú)顯著性差異。將RB+E處理組與RB組進(jìn)行對(duì)比,RB+E組中POD、CAT活性顯著升高。
如圖8所示,經(jīng)過(guò)E處理的水稻幼苗MDA含量顯著降低,RB處理的水稻幼苗無(wú)顯著變化。經(jīng)過(guò)RB+E處理的水稻幼苗MDA顯著低于CK。內(nèi)生菌侵染水稻幼苗對(duì)幼苗葉片膜質(zhì)過(guò)氧化有一定的緩解作用。
通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)生菌顯著提高水稻的防御酶活性,可以有效降低水稻膜脂過(guò)氧化作用,減小細(xì)胞膜的損傷,提高Chla含量。
在本研究中,稻瘟病菌感染水稻雖未引起顯著膜脂過(guò)氧化和防御酶活性的改變,但從熒光動(dòng)力學(xué)方面可以看出,感染稻瘟病菌水稻的PSⅡ已經(jīng)受到破壞,其ΔVOP、ΔVOK以及ΔVOJ的數(shù)值明顯大于零,說(shuō)明稻瘟病菌抑制了放氧復(fù)合體的活性,從而導(dǎo)致類囊體發(fā)生解離,抑制了PSⅡ的光化學(xué)活性。然而加入內(nèi)生菌后感染稻瘟病菌的水稻幼苗ΔVOP、ΔVOK以及ΔVOJ的數(shù)值均下降,這可能是內(nèi)生菌抑制了稻瘟病對(duì)PSⅡ的光化學(xué)活性的影響,使植物水稻光合作用正常進(jìn)行。張興華等[23]通過(guò)對(duì)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力曲線分析認(rèn)為干旱脅迫導(dǎo)致玉米光PSⅡ放氧復(fù)合體受到抑制。除此之外,被稻瘟病菌感染的水稻幼苗Chlb顯著降低,但內(nèi)生菌能夠提高感染稻瘟病菌水稻的Chla和Cars含量。在龔娜等[24]研究中,也發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌提取物拌種,會(huì)提高干旱脅迫下玉米苗期的葉綠素含量,增強(qiáng)光合能力。此外,PIABS可以準(zhǔn)確反映植物光合機(jī)構(gòu)的整體狀態(tài)[25]。RB+E組的PIABS值顯著高于RB組,說(shuō)明內(nèi)生菌處理可以提高水稻葉片對(duì)光能利用。用內(nèi)生菌處理感染稻瘟病菌的幼苗,其φEo和φPo顯著升高,而φDo顯著下降,表明內(nèi)生菌侵染能夠提高稻瘟病菌感染后用于電子傳遞的量子產(chǎn)額和最大光化學(xué)效率,降低用于熱耗散的量子比率,提高光合效率。RB+E組幼苗的ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC均低于RB組。這些結(jié)果表明單位反應(yīng)中心吸收的光能、捕獲光能的能力增加,可能是由于一些RCs失活,并認(rèn)為熱耗散是由于非活動(dòng)RCs的高耗散而增加[26]。
葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化可以作為探究植物的光合過(guò)程及一些環(huán)境因素對(duì)其影響的重要手段[27]。性能指數(shù)是JIP-test的參數(shù)中最敏感的參數(shù)之一[28]。稻瘟病菌感染的水稻幼苗,其性能指數(shù)、量子產(chǎn)額和最大光化學(xué)效率顯著下降,比活性參數(shù)顯著增加,說(shuō)明稻瘟病菌已經(jīng)影響PSⅡ的正常功能,而內(nèi)生菌處理的水稻幼苗則能夠維持PSⅡ穩(wěn)定性,保持高效的PSⅡ功能。
內(nèi)生菌侵染可以使水稻幼苗防御酶活性增強(qiáng),降低MDA含量,使葉片放氧復(fù)合體穩(wěn)定,電子傳遞正常進(jìn)行,保持高效的PSⅡ功能,從而提高水稻對(duì)稻瘟病的抗性。