姚宗澤，楊肖艷，楊昆紅，段 忠*，趙自仙

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)推廣研究院，云南 大理 671005；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650205；4.云南省綠色食品發(fā)展中心，云南 昆明 650032)

【研究意義】為探討形態(tài)鑒定和SSR標(biāo)記鑒定的差異，為玉米SSR標(biāo)記鑒定規(guī)程的完善提供理論依據(jù)。目前在國內(nèi)外，植物新品種DUS(特異性Distinctness、一致性Uniformity和穩(wěn)定性Stability)測試采用的方法仍是田間種植測試，DUS測試指南的研制仍然是以農(nóng)藝性狀為基礎(chǔ)。使得DUS測試存在著諸多問題[1-3]：測試周期長，人力物力投入大，易受病蟲害的影響和季節(jié)限制。DUS測試指南中選用的性狀多為數(shù)量性狀，數(shù)量性狀表現(xiàn)為連續(xù)分布，不容易分級[4]。玉米雜交種與自交系在形態(tài)性狀上有顯著差異，針對雜交種和自交系必須選用不同的標(biāo)準(zhǔn)，增加了測試的復(fù)雜性。理論上申請品種與近似品種之間存在差異，即申請品種是具有特異性的，但因?yàn)榻破贩N的選擇有限，所以并不能推導(dǎo)出申請品種與所有已知品種有差異。對于育種工作者成功選育出一個(gè)新品種后，并不希望將其親本詳細(xì)系譜公布出去，但目前為了測試需要這一信息，育種者不得不提供該信息，不利于保護(hù)育種者權(quán)益。目前品種的數(shù)量越來越多，導(dǎo)致現(xiàn)有的性狀指標(biāo)不能滿足品種特異性鑒定的需要[5]。同時(shí)，隨著骨干親本的集中利用，相似品種間的形態(tài)差異越來越小，專業(yè)技術(shù)人員在實(shí)際操作過程中經(jīng)常會(huì)難以執(zhí)行，從而延遲和阻礙了植物新品種授權(quán)以及仲裁等重大工作[6]。因此需尋求周期短、操作簡單、不受季節(jié)環(huán)境影響、且測試的指標(biāo)多、結(jié)果可靠的方法，來補(bǔ)充完善現(xiàn)有的DUS測試技術(shù)[4,7]。而DNA指紋技術(shù)就符合上述特點(diǎn)，能夠補(bǔ)充形態(tài)學(xué)上的缺點(diǎn)[8-9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】DNA指紋技術(shù)是在21世紀(jì)發(fā)展起來的新技術(shù)，現(xiàn)已在基因定位、輔助選擇育種、遺傳多樣性分析以及遺傳圖譜的構(gòu)建等很多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[10-17]，但直接在DUS測試中應(yīng)用的并不是很多。DNA分子技術(shù)的誕生和飛速發(fā)展，為DUS測試提供了更多的可能性，這些標(biāo)記中SSR標(biāo)記用于植物新品種測試是比較理想的。盡管當(dāng)前分子標(biāo)記尚未正式作為植物新品種判定的測試手段，但近年來，國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)仍在鼓勵(lì)各成員國要加快實(shí)現(xiàn)在分子標(biāo)記技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建領(lǐng)域的研究[18]。當(dāng)找到分子標(biāo)記與性狀表達(dá)之間的密切關(guān)聯(lián)時(shí)分子標(biāo)記技術(shù)就可以直接用于DUS測試，屆時(shí)可以通過分子距離與形態(tài)距離相結(jié)合進(jìn)行已知品種的管理，篩選近似品種時(shí)漏選的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)隨之大大降低。目前我國大多數(shù)有關(guān)分子標(biāo)記鑒定方面的研究成果仍處于報(bào)道層面，在植物新品種保護(hù)中的應(yīng)用也僅限于近似品種的輔助篩選上[9,19]，目前仍未能取代形態(tài)學(xué)性狀單獨(dú)用于DUS測試中的特異性鑒定[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究先用姚宗澤等[20]篩選的20對核心引物，對45個(gè)雜交玉米品種進(jìn)行特異性和多樣性分析。同時(shí)，通過田間種植測試了45個(gè)雜交玉米品種的38個(gè)必測性狀，基于形態(tài)性狀對45個(gè)雜交玉米品種進(jìn)行特異性和多樣性分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】綜合比較分析形態(tài)性狀鑒定法與SSR標(biāo)記鑒定法，為以后玉米SSR標(biāo)記鑒定規(guī)程的修訂提供依據(jù)，為提高工作效率、加速品種鑒定提供可能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究共45個(gè)玉米雜交種(表1)，包括從云南市場上購買的22個(gè)雜交玉米品種和云南種業(yè)集團(tuán)聯(lián)合體提供的23個(gè)區(qū)試品種。本研究選用的20對SSR核心引物是由姚宗澤等[20]從玉米SSR標(biāo)記鑒定規(guī)程推薦的引物中篩選而來。研究中的SSR鑒定部分于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院五號(hào)樓6樓種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，田間測試于楚雄州姚安縣棟川鎮(zhèn)大龍口村朱姓小組趙自仙教授的試驗(yàn)地上進(jìn)行。

表1 45個(gè)雜交玉米品種編號(hào)、名稱及來源

續(xù)表1Continued table 1

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SSR標(biāo)記鑒定 具體操作過程參照玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程-SSR標(biāo)記法中的方法步驟進(jìn)行[21]。

1.2.2 SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果分析 特異性分析：根據(jù)每對引物擴(kuò)增的多態(tài)性片段的分子量按從大到小排列，用“1”和“0”分別代表某一擴(kuò)增片段的有與無，記錄各玉米品種的等位基因類型。統(tǒng)計(jì)每兩個(gè)雜交玉米品種間的差異位點(diǎn)數(shù)目，差異位點(diǎn)數(shù)目即2個(gè)品種間的分子差異值[22]，利用Excel 2017統(tǒng)計(jì)每兩個(gè)雜交玉米品種間的分子差異值，材料編號(hào)從V01開始，按編號(hào)順序依次統(tǒng)計(jì)每兩個(gè)雜交玉米品種間的分子差異值，共計(jì)990個(gè)數(shù)。當(dāng)分子差異值≥2，則判定為不同品種，即具有特異性；否則，判定為不具有特異性[21]。SSR遺傳多樣性分析和聚類分析：參照唐浩等[23-25]在水稻中的分析方法。

1.2.3 田間形態(tài)性狀測試 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理參照姚宗澤等[19]具體設(shè)計(jì)，性狀的觀測、判別與分級參考玉米DUS測試指南[26]及性狀分級標(biāo)準(zhǔn)[27]進(jìn)行，其中28個(gè)田間測試性狀(表2)和10個(gè)室內(nèi)測試性狀(表3)。

表2 28個(gè)田間調(diào)查性狀

表3 10個(gè)室內(nèi)調(diào)查性狀

1.2.4 田間測試結(jié)果分析 特異性分析：45個(gè)雜交玉米品種的38個(gè)必測性狀測試之后，將每個(gè)品種每個(gè)性狀測試結(jié)果按玉米DUS測試及性狀分級標(biāo)準(zhǔn)[27]轉(zhuǎn)為代碼。將2個(gè)雜交玉米品種間每個(gè)性狀代碼之差絕對值的和記為2個(gè)品種間的形態(tài)差異值[22]，利用Excel 2017統(tǒng)計(jì)每2個(gè)雜交玉米品種間的形態(tài)差異值。從材料V01開始，按編號(hào)順序依次統(tǒng)計(jì)每兩個(gè)雜交玉米品種間的形態(tài)差異值，共記990個(gè)數(shù)，當(dāng)形態(tài)差異值≥2，判定該品種具有特異性[26]。必測性狀多樣性分析和聚類分析：具體參照唐浩等[23-25]在水稻中的分析方法。

1.2.5 品種間分子差異與形態(tài)差異的比較分析 用45個(gè)雜交玉米品種的分子差異值與形態(tài)差異值進(jìn)行比較分析,每種差異值均有990個(gè)數(shù)據(jù)，每個(gè)數(shù)據(jù)均是通過兩個(gè)雜交玉米品種進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)得出，將數(shù)據(jù)的排序直接記為對應(yīng)的2個(gè)雜交玉米品種的組合序號(hào)，便于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。參照張華生等[22]人的分析方法，以45個(gè)雜交玉米品種間的形態(tài)差異值為縱坐標(biāo)，分子差異值為橫坐標(biāo)作散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于SSR標(biāo)記的45個(gè)雜交玉米品種特異性鑒定分析

由表4可知，45個(gè)雜交玉米品種間的分子差異值為12～108，表明每兩個(gè)雜交玉米品種間的差異位點(diǎn)均大于2，故45個(gè)雜交玉米品種均具有特異性。統(tǒng)計(jì)990組雜交玉米品種間的分子差異值，20對核心引物在45個(gè)雜交玉米品種中檢測出平均每兩個(gè)品種間的分子差異值為75.60，平均每對核心引物在兩個(gè)雜交玉米品種間檢測出3.78個(gè)分子差異值。

表4 45個(gè)雜交玉米品種間的分子差異值

續(xù)表4Continued table 4

續(xù)表4Continued table 4

2.2 基于形態(tài)性狀測試的45個(gè)雜交玉米品種特異性鑒定分析

由表5可知，45個(gè)雜交玉米品種間的形態(tài)差異值為12～69，表明每兩個(gè)雜交玉米品種間的代碼差異均大于2，即45個(gè)雜交玉米品種均具有特異性。統(tǒng)計(jì)990組雜交玉米品種間的形態(tài)差異值，38個(gè)必測性狀在45個(gè)雜交玉米品種中檢測出平均每兩個(gè)品種間的形態(tài)差異值為40.40，平均每個(gè)性狀在兩個(gè)雜交玉米品種間檢測出1.06個(gè)形態(tài)差異值。

表5 45個(gè)雜交玉米品種間的形態(tài)差異值

續(xù)表5Continued table 5

續(xù)表5Continued table 5

2.3 SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析

由表6可知，20對SSR核心引物在45個(gè)雜交玉米品種中檢測到218個(gè)等位變異，平均每對引物檢測到10.90個(gè)，變幅為7～16個(gè)；平均Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)為2.8922，變幅為1.6293～4.8211；平均有效等位變異為3.1600，變幅為1.2696～4.8252。

表6 20對SSR標(biāo)記在45個(gè)雜交玉米品種中的多樣性參數(shù)

表7 38個(gè)必測性狀在45個(gè)雜交玉米品種中的多樣性參數(shù)

圖1 基于SSR分子標(biāo)記的45個(gè)雜交玉米品種聚類結(jié)果Fig.1 Clustering results of 45 maize hybrid varieties based on SSR molecular markers

2.4 雜交玉米品種必測性狀多樣性分析

由表7可知，38個(gè)性狀在45個(gè)玉米雜交種中檢測到178個(gè)等位變異，平均每個(gè)性狀檢測到4.6842個(gè)，變幅為1～8個(gè)；果穗籽粒顏色數(shù)量(C33)多樣性表現(xiàn)差異較大，果穗籽粒顏色數(shù)量(C33)在45個(gè)玉米品種中只出現(xiàn)1種，雄穗穎片除基部外花青甙顯色強(qiáng)度(C10)則是8種，有效等位變異數(shù)目為5.9121，Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)為1.9597。雄穗花藥花青甙顯色強(qiáng)度(C11)、雄穗側(cè)枝與主軸夾角(C13)、雄穗側(cè)枝彎曲程度(C14)和莖稈支持根花青甙顯色強(qiáng)度(C21)在45個(gè)玉米品種中均出現(xiàn)7種等位變異，有效等位變異數(shù)目分別為4.2187、4.0644、4.0674、4.1666，Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)分別為1.5544、1.6824、1.7406、1.5757。

圖2 基于必測性狀的45個(gè)雜交玉米品種聚類結(jié)果Fig.2 Clustering results of 45 maize hybrid varieties based on characteristics essential to be tested

只出現(xiàn)1種，所以沒有對其進(jìn)行多樣性分析，其余37個(gè)性狀平均Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)為1.2593，變幅為0.4236～1.9982；平均有效等位變異為2.7830，變幅為1.0539～5.9121。不同性狀的

圖3 45個(gè)雜交玉米品種間分子差異值與形態(tài)差異值的散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of molecular difference and morphological difference between 45 maize hybrid varieties

2.5 基于SSR標(biāo)記的聚類結(jié)果

對45個(gè)雜交玉米品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖1所示，45個(gè)品種間的相似系數(shù)為0.62～0.94。根據(jù)聚類結(jié)果可將其劃分為3大類群：第Ⅰ類群有5個(gè)玉米雜交種，占11.1%；第Ⅱ類群有9個(gè)玉米雜交種，占20.0%；第Ш類群有31個(gè)玉米雜交種，占68.9%。

2.6 基于形態(tài)性狀的聚類結(jié)果

對45個(gè)玉米品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示，45個(gè)品種間的形態(tài)相似系數(shù)為0.31～0.68。根據(jù)聚類結(jié)果可將其劃分為3大類群：第Ⅰ類群包括5個(gè)玉米雜交種，占11.1%；第Ⅱ類群包括25個(gè)玉米雜交種，占55.6%；第Ⅲ類群包括15個(gè)玉米雜交種，占33.3%。

2.7 分子差異值與形態(tài)差異值的散點(diǎn)分布

由圖3可知，同一組雜交玉米品種間的分子差異值要大于形態(tài)差異值，990個(gè)散點(diǎn)高度聚集在一起，中心坐標(biāo)大概在(80，40)位置，其他散點(diǎn)緊密分布在中心坐標(biāo)周圍，有較少部分點(diǎn)零散分布在其他位置。

2.8 分子差異值與形態(tài)差異值的相關(guān)性分析

由圖4可知，雜交玉米品種間的分子差異值隨形態(tài)差異值的變化而變化，兩條折線趨勢高度一致，分子差異值與形態(tài)差異值之間呈極顯著正相關(guān)。故可以通過兩個(gè)雜交玉米品種間的形態(tài)差異值預(yù)測分子差異值，反之亦然。由折線圖5可知，分子差異值與形態(tài)差異值的比圍繞一個(gè)固定數(shù)值上下波動(dòng)，但振幅不大，這個(gè)固定值約等于2。通過分析得出，平均分子差異值是形態(tài)差異值的1.9382倍。

圖4 45個(gè)雜交玉米品種間分子差異值與形態(tài)差異值相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between molecular difference and morphological difference in 45 maize hybrid varieties

圖5 45個(gè)雜交玉米品種間分子差異與形態(tài)差異的比值Fig.5 Ratio of molecular difference to morphological difference between 45 maize hybrid varieties

3 討 論

在45個(gè)雜交玉米品種間，分子差異值為12～108，形態(tài)差異值為12～69，分子差異值大于形態(tài)差異值，張華生等[22]人也有類似的研究結(jié)果。但鑒定結(jié)果顯示，45個(gè)雜交玉米品種均具有特異性，結(jié)果并無沖突。導(dǎo)致分子差異值較形態(tài)差異值高，可能是因?yàn)槠贩N間的一些差異無法通過觀察表型辨別。而且同一組材料不同技術(shù)人員進(jìn)行辨別，其判定結(jié)果也可能有差異[9]。正如Smith等人[28-29]的觀點(diǎn)，最理想的品種鑒定技術(shù)應(yīng)該是具有較好的可操作性、精確性、可靠性和高度的自動(dòng)化。從這一角度考慮，使用標(biāo)準(zhǔn)的分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行特異性鑒定，判定結(jié)果可能更加穩(wěn)定可靠，更接近真實(shí)存在，具有說服力。所以，加強(qiáng)和加快相關(guān)領(lǐng)域的研究迫在眉睫。

20對SSR核心引物在45個(gè)雜交玉米品種中共檢測到218個(gè)等位變異，平均每個(gè)引物檢測到10.90個(gè)，變幅為7～16；平均Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)為2.8922，變幅為1.6293～4.8211；平均有效等位變異為3.1600，變幅為1.2696～4.8252。38個(gè)必測性狀在45個(gè)雜交玉米品種中檢測到178個(gè)等位變異，平均每個(gè)性狀檢測到4.6842個(gè)，變幅為1～8個(gè)；平均Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)為1.2593，變幅為0.4236～1.9982；平均有效等位變異為2.7830，變幅為1.0539～5.9121。從多樣性參數(shù)，可以看出，在45個(gè)雜交玉米品種間通過SSR標(biāo)記分析的多樣性要比形態(tài)鑒定結(jié)果豐富，與特異性鑒定結(jié)果保持一致。

通過SSR分子標(biāo)記和形態(tài)性狀2種分析，45個(gè)雜交玉米品種相似系數(shù)分別為0.62～0.94、0.31～0.68，聚類結(jié)果均可將45個(gè)雜交玉米品種劃分為3大類群。云黃3號(hào)(V06)與地沃2號(hào)(V35)、卓玉6009(V25)與足單707(V30)在兩種聚類結(jié)果中，均呈現(xiàn)有較高相似系數(shù)。SSR標(biāo)記的聚類結(jié)果中，第Ι類群包括勝玉607(V09)、大天1號(hào)(V12)、益單518(V15)、貝玉001(V21)、宣瑞6號(hào)(V24)5個(gè)品種；形態(tài)性狀的聚類結(jié)果中，該5個(gè)品種仍聚在一起，位于第П類群。形態(tài)性狀的聚類結(jié)果中，第Ι類群包括水金玉1號(hào)(V04)、勝白玉2號(hào)(V11)、宣白玉2號(hào)(V19)、保玉7號(hào)(V37)、會(huì)單4號(hào)(V38)5個(gè)品種，該5個(gè)品種在SSR標(biāo)記聚類結(jié)果中仍聚集在一起，位于第П類群。位于第Ш類群的雜交玉米品種，在兩種結(jié)果中重合度較高。表明SSR標(biāo)記鑒定和形態(tài)性狀鑒定不同雜交玉米品種時(shí)，盡管結(jié)果不能完全一致，但特異性鑒定結(jié)果可信度比較高。黃婷等[30]人篩選出20對SSR引物，并分析得出SSR分子標(biāo)記用于多花黑麥草品種鑒定具有可行性。

同一組雜交玉米品種間的分子差異值與形態(tài)差異值之間存在極顯著正相關(guān)，分子差異值隨形態(tài)差異值的增加而增加。由圖5可以看出，分子差異值與形態(tài)差異值的比值是聯(lián)系兩者關(guān)系的關(guān)鍵。通過分析得出，平均分子差異值是形態(tài)差異值的1.9382倍。根據(jù)玉米DUS測試指南中判定玉米品種特異性的標(biāo)準(zhǔn)[26]和張華生[22]等人的研究，以形態(tài)差異值≥2可作為品種特異性判定標(biāo)準(zhǔn)。則分子差異值應(yīng)為形態(tài)差異值的1.9382倍，即3.8764，故建議將SSR標(biāo)記鑒定中分子差異值≥4，作為一個(gè)申請品種具有特異性的判定標(biāo)準(zhǔn)。

與形態(tài)性狀鑒定相比，SSR標(biāo)記鑒定有重復(fù)性好、判定結(jié)果客觀、不易受環(huán)境條件及操作人員的影響等優(yōu)點(diǎn)。雖然在品種鑒別中發(fā)揮重要作用，但目前分子標(biāo)記鑒定仍未能取代形態(tài)性狀鑒定，單獨(dú)用于玉米品種DUS測試中申請品種的特異性鑒定。許多研究表明，分子標(biāo)記與形態(tài)性狀之間的相關(guān)性不夠充分，本研究表明兩者之間存在極顯著相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)只為0.27。說明即使品種DNA之間存在差異，但可能由于差異基因不參與表達(dá)或發(fā)生突變，導(dǎo)致表型之間沒有差異。或者，兩個(gè)品種間基因差異很小，但由于外界環(huán)境的影響，兩者表型差異較大[9]。故本研究也不建議將SSR標(biāo)記單獨(dú)用于玉米品種的特異性鑒定。為保證新品種具有一定的自主創(chuàng)新，建議將分子差異值≥4作為玉米品種特異性的判定標(biāo)準(zhǔn)，即申請品種與近似品種間至少有4個(gè)差異位點(diǎn)，才能判定為不同品種。

4 結(jié) 論

45個(gè)雜交玉米品種分子差異值范圍為12～108，20對核心引物在45個(gè)雜交玉米品種中檢測出平均每兩個(gè)品種間的分子差異值為75.60，平均每對核心引物在兩個(gè)雜交玉米品種間檢測出3.78個(gè)分子差異值。20對SSR引物在45個(gè)雜交玉米品種中共檢測到218個(gè)等位變異，平均每個(gè)引物檢測到10.90個(gè)，變幅為7～16個(gè)；平均Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)為2.8922，變幅為1.6293～4.8211；平均有效等位變異為3.1600，變幅為1.2696～4.8252。45個(gè)雜交玉米品種間的相似系數(shù)為0.62～0.94，根據(jù)聚類結(jié)果，可將45個(gè)雜交玉米品種劃分為三大類群。

45個(gè)雜交玉米品種形態(tài)差異值范圍為12～69，38個(gè)必測性狀在45個(gè)雜交玉米品種中檢測出平均每兩個(gè)品種間的形態(tài)差異值為40.40，平均每個(gè)性狀在兩個(gè)雜交玉米品種間檢測出1.06個(gè)形態(tài)差異值。在田間種植的45個(gè)雜交玉米品種具有較豐富的形態(tài)變異，38個(gè)必測性狀在45個(gè)雜交玉米品種中檢測到178個(gè)等位變異，平均每個(gè)性狀檢測到4.6842個(gè)，變幅為1～8個(gè)；平均Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)為1.2593，變幅為0.4236～1.9982；平均有效等位變異為2.7830，變幅為1.0539～5.9121。45個(gè)雜交玉米品種間的形態(tài)相似系數(shù)為0.31～0.68，根據(jù)聚類結(jié)果，可將45個(gè)雜交玉米品種劃分為3大類群。兩個(gè)雜交種間的分子差異值大于形態(tài)差異值，平均分子差異值是形態(tài)差異值的1.94倍，建議將SSR標(biāo)記鑒定中分子差異值≥4，作為判定玉米申請品種具有特異性的標(biāo)準(zhǔn)。