代文東，鐵拿優(yōu)，瑪麗亞，張 超 ，唐 容， 王少銘，楊 斌，王璐璐，饒 勇，黃澤素*

(1.貴州省農業(yè)科學院油料研究所，貴州 貴陽 550006；2.蘇蘭拉里理工大學農學院，泰國 呵叻府 30000)

【研究意義】花青素是植物體內重要的次生代謝產物，是形成植物花和果實顏色的主要色素[1]。目前，自然界中已發(fā)現(xiàn)的花色苷主要由天竺葵素、矢車菊素等6類花青素衍生而來，不同花色苷種類及環(huán)境條件使植物顯現(xiàn)不同的顏色[2]。研究表明，花青素具有使植物體抵御低溫凍害[3]，提升抗旱能力[4]，增強抗寒能力[5]的作用。此外，植物花青素還具有抗氧化、抗炎癥、保護心腦血管、預防阿爾茲海默病等生物保健功能[6-7]。葉綠素是植物光合作用的重要色素，其含量的高低對植物的生長發(fā)育具有重要的影響[8]。因此，花青素和葉綠素的遺傳改良在植物高產、抗逆、觀光、保健等多功能新品種選育上具有較大的應用前景?！厩叭搜芯窟M展】近年來，受極端氣候的影響，抗逆性成為油菜新品種選育的主攻目標之一。同時，隨著油菜的菜用、農旅觀光等多用途的推廣應用，營養(yǎng)保健價值高、色彩豐富多樣化的油菜種質創(chuàng)新逐漸受到廣大科研人員的重視[9]。植物花青素生物合成受結構基因及轉錄因子協(xié)同調控[10]，“MBW”復合體(MYB，bHLH和WD40錄因子)調控花青素生物合成結構基因的表達[11-12]，目前在擬南芥[13]、紫菜薹[14]、黑果枸杞[15]、洋蔥[16]、苦蕎[17]等植物花青素相關合成調控基因上得到深入研究。在甘藍型油菜中，除Li等[18]采用圖位克隆定位到位于A03染色體上的BnaA.PL1可能是調控紫紅葉的主要候選基因外，少有調控甘藍型油菜紫紅葉的基因被報道。Wang等[19]利用甘藍型油菜葉綠素缺乏突變體“cde1”與中雙11構建的分離群體，在C08染色體上定位到22個候選基因可能與葉綠素含量相關；Zhao等[20]利用黃化突變體“yvl”與綠葉“ZS9”構建的分離群體，通過BSA-seq定位發(fā)現(xiàn)BnaA03.CHLH在突變體中單堿基突變導致葉綠體發(fā)育和葉綠素合成受到影響。此外，在甘藍型油菜中BnaC07.HO1的缺失也會導致葉綠素的合成受到影響[21]，薦紅舉等[22]采用全基因組關聯(lián)分析篩選到5個葉綠素合成途徑相關的候選基因。綜上可見，油菜葉片中花青素和葉綠素的合成和調控相對復雜?！颈狙芯壳腥朦c】針對甘藍型油菜多功能應用對葉色、生物保健等特異功能型品種的需求，利用貴州省油料研究所通過遠緣雜交育成的紫紅葉甘藍型油菜新品系構建遺傳分離群體，對葉片花青素及葉綠素含量的遺傳機制開展研究?！緮M解決的關鍵問題】通過選擇紫紅葉和綠葉油菜品系構建遺傳分離群體，定位相關性狀的數量性狀位點(Quantitative trait loci，QTL)，為研究甘藍型油菜葉片花青素和葉綠素的分子遺傳機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

利用甘藍型紫紅葉油菜10-Zi006與綠葉油菜10-4438雜交，以10-4438回交構建包含91個單株的BC1群體[23]，分別測定群體單株的葉片花青素和葉綠素含量；通過DarT-seq技術對BC1群體單株進行基因分型并構建連鎖遺傳圖譜，圖譜包含1614個bin(含9212個SNP和insilicoDarTs多態(tài)性標記)、構成21個連鎖群、覆蓋甘藍型油菜19條染色體、總長3616.38 cM，標記平均遺傳距離2.24 cM。

1.2 田間試驗

BC1群體及雙親種植于貴州省農業(yè)科學院貴州省油料研究所貴陽試驗地內。采用育苗移栽，行距45 cm，行長240 cm，每行種植8窩，每窩2株移栽，其中，BC1群體共91個單株。育苗、移栽、施肥等按大田生產方式管理。

1.3 表型測定

采用分光光度法測定葉片花青素相對含量[24]，于油菜苗期(6～7葉)取平展頂葉，群體樣品取樣同一天完成；單株取300 mg新鮮樣品加入1 mL的酸性甲醇(1% HCl,w/v)，室溫下震蕩18 h后離心1 min，取400 μL上清液加到600 μL 酸性甲醇中，利用UV-7504分光光度計測定530和657 nm的吸光度，花青素相對含量= (吸光度530-0.25×吸光度657)/樣品重量。采用日本柯尼卡美能達葉綠素測定儀(SPAD-502 Plus)測定葉片葉綠素含量，于苗期6～7葉時測定平展頂葉，每個單株測定5次取平均值。群體親本花青素相對含量、葉綠素含量測定方法同上，每個親本測5個單株取平均值。

1.4 QTL定位與候選基因預測

采用Windows QTL Cartographer 2.5的復合區(qū)間作圖(Composite interval mapping,CIM)法進行QTL定位[25]。在顯著性水平(P<0.05)的條件下，進行1000次排列檢驗(Permutation test)，窗口大小10 cM，步長為2 cM，置信區(qū)間設為95%。QTL命名參照標準命名法[26]，即q+性狀英文首字母+連鎖群，若同一條連鎖群上檢測到多個QTL，依據順序進行編號。通過blastn(E-value = 0.0000005，堿基一致性≥90%)將定位到的QTL置信區(qū)間內的標記與甘藍型油菜基因組(Darmor-bzh v4.1)進行比對，確定QTL的物理位置和區(qū)段，并根據參考基因組的基因注釋挖掘QTL區(qū)段內與花青素(Anthocyanin Content AC)和葉綠素含量(Chlorophyll Content CC)相關的候選基因。

表1 雙親及BC1群體葉片花青素及葉綠素(SPAD)含量

2 結果與分析

2.1 雙親及BC1群體葉片花青素及葉綠素(SPAD)含量的變化

從表1可見，親本10-Zi006和10-4438葉片花青素相對含量分別為2.08和0.19，差異達極顯著水平。BC1群體91個單株花青素相對含量均值為0.35，單株最大值和最小值分別為0.65和0.20，變異系數為0.32，偏度和峰度值分別為3.22和0.11，群體花青素相對含量呈連續(xù)性的偏態(tài)分布，且偏向綠葉油菜親本(圖1)；群體葉片葉綠素含量(SPAD)均值為54.05，最大值和最小值分別為62.28和43.58，變異系數為0.08，偏度和峰度值均為-0.73，SPAD值在BC1群體中的分布符合連續(xù)正態(tài)分布(圖1)。

2.2 葉片花青素含量的QTL定位

從表2和圖2看出，在BC1群體中共檢測到14個甘藍型油菜葉片花青素含量QTL，分別位于a03、a04、a05、a06、c02和c04連鎖群上，其中，在a03連鎖群中上部共檢測到4個花青素含量相關QTL“qAC-a03-1、qAC-a03-2、qAC-a03-3、qAC-a03-4”，貢獻率分別為19.13%、11.47%、13.77%及9.17%，加性效應值分別為0.25、-0.22、-0.24及-0.20；在a04連鎖群中部檢測到1個花青素QTL，為qAC-a04，貢獻率為12.21%，加性效應值為0.18；在a05連鎖群的尾部區(qū)域檢測到3個QTL，分別為qAC-a05-1、qAC-a05-2、qAC-a05-3，貢獻率分別為17.86%、12.19%及9.35%，加性效應值分別為0.30、-0.22和-0.14；在a06連鎖群尾部區(qū)域檢測到2個QTL，分別為qAC-a06-1和qAC-a06-2，貢獻率分別為14.32%和12.76%，加性效應值分別為0.15和-0.21；在c02連鎖群中上部檢測到1個QTL，為qAC-c02，貢獻率為9.58%，加性效應值為-0.19；在c04連鎖群中上部區(qū)域檢測到3個QTL，貢獻率分別為14.11%、13.05%和12.68%，加性效應值分別為-0.16、-0.16和0.20。

花青素相對含量QTL與甘藍型油菜參考基因組比對結果顯示：qAC-a03-1定位在甘藍型油菜chrA03染色體14 375 878～14 531 029 bp或7974 055～9494 481 bp處；qAC-a03-2定位在chrC03染色體15 157 498～15 305 606 bp或chrA03染色體15 241 024～15 451 083 bp處；qAC-a03-3定位在chrC3染色體23 258 741～23 290 766 bp處；qAC-a03-4定位在chrC03染色體23 290 766～23 961 992 bp或chrA03染色體23 378 247～23 894 826 bp處。qAC-a04定位在chrAnn_random染色體24 108 187～24 334 179 bp處；qAC-a05-1定位在chrA05染色體20 836 827～20 860 866 bp處、qAC-a05-2和qAC-a05-3分別定位在chrA05染色體的21 076 461～21 273 466和21 468 153～21 958 297 bp處；qAC-a06-1定位在chrC07染色體26 581 773～27 205 442 bp或chrAnn_random 26 119 902～26 408 031 bp處、qAC-a06-2分別定位在chrC07染色體32 973 868～32 976 167 bp處；qAC-c02定位到chrC02染色體的39 004 304～397 809 943 bp處；qAC-c04-1、qAC-c04-2及qAC-c04-3分別定位在chrC04、chrA05和chrC04_random的41 372 213、13 208 159和3672 853 bp處。

圖1 BC1群體花青素相對含量及葉綠素含量(SPAD值)的頻次分布Fig.1 Frequency distribution of leaf anthocyanin and chlorophyll content in BC1 population

表2 甘藍型油菜葉片花青素含量QTL

圖2 花青素QTLs在遺傳連鎖圖譜上的位置Fig.2 The location of anthocyanin QTLs on genetic linkage map

表3 甘藍型油菜葉片葉綠素素含量QTL

圖3 葉綠素QTLs在遺傳連鎖圖譜上的位置Fig.3 The location of chlorophyll QTLs on genetic linkage map

表4 甘藍型油菜葉片花青素含量QTL置信區(qū)間的候選基因

2.3 葉片葉綠素含量的QTL定位

表3和圖3顯示，在BC1群體中，共檢測到8個甘藍型油菜葉片葉綠素含量QTL，分別位于a01、a03、a06、a07、c01、c03和c04連鎖群上，其中，在a01連鎖群中下部檢測到1個QTL，為qCC-a01，貢獻率為11.87%，加性效應值為-9.20；在a03連鎖群尾部檢測到2個QTL，為qCC-a03-1和qCC-a03-2，貢獻率分別為11.35%和13.07%，加性效應值分別為7.89和-7.38；在a06、a07、c01、c03和c04連鎖群上各檢測到1個QTL，分別為qCC-a06、qCC-a07、qCC-c01、qCC-c03和qCC-c04，貢獻率分別為10.67%、12.44%、8.56%、4.45%和11.15%，加性效應值為分別為7.85、-4.99、-5.50、8.86和-5.32。

qCC-a03-1定位在chrC07或chrA03或chrAnn_random染色體的40 195 918～42 813 040、8514 969～9503 464和40 416 892～43 532 944 bp間；qCC-a03-2定位在chrA03或chrAnn_random染色體5844 483～9288 940和45 167 243～48 597 583 bp間；qCC-a06定位在chrA06或chrAnn_random染色體16 524 327～16 746 972和21 398 996～21 398 996 bp間；qCC-a07定位在chrA07或chrCnn_random或chrC06染色體17 713 130～17 879 685、16 027 129～16 069 799 bp或26 172 817～26 326 124 bp間；qCC-c01定位在chrC01或chrAnn_random染色體10 969 542～11 114 856 bp或32 703 675～40 769 451 bp間；qCC-c03定位在chrC03或chrA08或chrC03_random染色體49 137 343～50 108 660、12 916 728～13 809 226 bp或4729 273～5064 423 bp間；qCC-c01緊密連鎖標記分別比對到不同的染色體上；qCC-c04緊密連鎖標記未能比對到甘藍型油菜染色體的相關位置。

表5 甘藍型油菜葉片葉綠素含量QTL置信區(qū)間的候選基因

3 討 論

貴州省農業(yè)科學院貴州省油料研究所通過遺傳改良，已育成一批雙低紫紅葉甘藍型油菜品系[27]，可在油菜標記雜種識別，提高種子純度等方面發(fā)揮作用[28]。該紫紅葉油菜材料苗期自子葉開始，葉片呈現(xiàn)紫紅色，因品系不同葉色紫紅程度有較大差異，于油菜抽薹期開始葉色逐漸退成正常綠色，與綠葉油菜相比，紫紅葉油菜葉片花青素顯著高于綠葉油菜，利用紫紅葉品系與綠葉油菜品系雜交，雜種F1葉片葉綠素與花青素含量呈不顯著的正相關[29]，說明該紫紅葉油菜材料可應用在雜交油菜品種的選育上。為了促進該油菜與農旅觀光和蔬菜產業(yè)相結合，開展葉片花青素含量、葉綠素含量等性狀分子遺傳基礎研究，為材料的遺傳改良奠定基礎具有重要的意義。

近年來，有關花青素合成調控基因的研究重點植物集中在食用水果、蔬菜、糧食和觀賞花卉類，如梨[30]、桑椹[31]、青花菜[32]、蘭科植物[1]等。目前，在白菜1號染色體[33]、R07連鎖群[34]、白菜基因組A07染色體[35]及A03連鎖群r[36]均定位到與紫葉相關的基因或QTL；采用同源克隆的方法，王建軍等[14]在紫菜薹中克隆BrbHLH49基因，并在轉基因擬南芥植株中發(fā)現(xiàn)顯著提高花青素的合成；華中農業(yè)大學研究也表明，轉錄因子TT8調控蕓薹屬植物花青素合成基因上調表達，具有重要的調控功能[37]。由此表明在十字花科蕓薹屬作物中，花青素的生物合成普遍存在，但在甘藍型油菜中花青素的合成機制知之甚少。本研究中，檢測到14個調控甘藍型油菜合成的QTL，通過與甘藍型油菜基因組比對，分別定位在甘藍型油菜A03、C03、A04、A05、C07、C02和C04染色體上，其中5個QTL具有正向加性效應，來源于紫紅葉油菜品系。在定位的葉片花青素相關的QTL區(qū)段內，根據基因功能注釋，找到了可能與花青素相關的候選基因，這些候選基因中有較多的轉錄因子，如BnaC03g26620D(擬南芥同源基因AT2G26960，MYB81)、BnaC02g36230D和BnaC03g38310D(擬南芥同源基因AT3G26660，LBD24)、BnaA03g46550D(擬南芥同源基因AT4G24240，WRKY7)等，而bZIP家族、MYB家族、LOB家族、MADS家族、zf-HD家族和C2H2等家族轉錄因子均與花青素的轉化顯著相關[38-39]，MYB-bHLH-WD轉錄因子還能形成復合體協(xié)同調控花青素的形成[40]。此外，在A03染色體上的候選基因BnaA03g17120D/BnaA03g17130D對應擬南芥的同源基因為AT2G37260(Transparent testa glabra 2，TTG2)，TTG2與TTG1高度相似，均屬于WD-40蛋白家族[41]，而TTG1已被證實在種皮類黃酮和花青素的合成中具有重要的作用[42]。花青素相對含量QTL區(qū)段內細胞色素蛋白P450也較多，該蛋白在花色的形成中具有重要的功能[43]，暗示這些蛋白也可能參與調控了甘藍型油菜葉片花青素的合成。UGT-糖基轉移酶也對花青素的合成具有促進作用[44]，可見花青素的修飾加工相關的基因(如：BnaC03g26760D、BnaA05g30520D等)也值得關注。

葉綠素主要參與植物的光合作用，對植物的生長發(fā)育至關重要[8]。研究表明葉綠體的發(fā)育、葉綠素的合成及降解等均能影響葉綠素含量[19-21]，葉綠素含量性狀也是多基因調控[19,22]。共檢測到8個甘藍型油菜葉片葉綠素含量QTL，根據QTL區(qū)段內基因的功能注釋篩選43個基因可能與葉片葉綠素含量相關，其中，BnaC07g40900D對應的擬南芥同源基因為AT4G27440(Protochlorophyllide oxidoreductase B，PORB)，該酶是葉綠素的合成的關鍵酶[45]。葉綠素含量相關的QTL區(qū)段內還篩選出了BnaC07g41520D(AT3G24430，HCF101)和BnaC07g43330D(AT4G31560，HCF153)等基因，在玉米中HCF60的突變會導致植株溫度、光照依賴型的葉綠素缺陷[46]，可見高葉綠素熒光類的蛋白對葉綠素含量也具有重要的影響。另外，在水稻中Non-yellowcoloring3(NYC3)的功能缺失會導致水稻葉片衰老過程中持綠性加強[47]，暗示葉綠素含量QTL內基因BnaAnng41980D(擬南芥同源基因AT4G13250，NYC1)也可能與葉綠素含量相關。

4 結 論

本研究定位了14個花青素相對含量的QTL和8個葉綠素含量的QTL。對QTL物理區(qū)間的基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)了部分轉錄因子、細胞色素P450蛋白及UGT-糖基轉移蛋白等可能參與調控葉片花青素的合成，PORB，HCF，NYC等基因可能與葉綠素含量相關。篩選上述染色體相關區(qū)域內可能存在調控甘藍型油菜葉片花青素和葉綠素合成的相關候選基因，是進一步開展基因功能驗證，明確該性狀遺傳機制的基礎。